电针心包经穴对MCAO 大鼠急性期D-ser 及NMDAR 的影响

2023-02-14袁柳媚卢小叶娄必丹

海南医学院学报 2023年2期

袁柳媚，夏云，卢小叶，刘蕾，周颖，娄必丹

（1. 湖南中医药大学，湖南长沙 410007；2. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007；3. 广东南华工商职业学院，广东广州 510507；4. 长沙卫生职业学院，湖南长沙 410100）

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）作为我国最常见的卒中类型［1］，其发病机制和治疗方法一直是研究的热点。N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）介导的兴奋性毒性是脑卒中研究的热点，而D-丝氨酸（D-Serine，D-Ser）作为NMDAR 的NR1 亚基上“甘氨酸位点”的主要内源性配体，能调控NMDAR的功能［2］。基于心脑共主神明的理论［3］，本课题团队前期研究［4-7］证实电针心包经能改善MCAO 大鼠神经功能缺损症状，其治疗机制与调控D-Ser 的合成与释放，调节NR1、NR2A、NR2B 的表达，影响胞内Ca2+含量密切相关。本实验在前期研究的基础上，以加入外源性D-Ser 试剂为切入点，进一步探讨电针心包经在急性期对MCAO 大鼠脑组织D-ser 含量及NMDAR 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

实验动物为36 只SPF 级健康成年雄性SD 大鼠，购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体重250～300 g，3～4 月龄。随机分为以下6 组：分别是正常组、假手术组、模型组、电针心包经组、模型+D-Ser 组、电针心包经+D-Ser 组。严格按照动物伦理学要求善待动物。

1.2 主要试剂与仪器

常规化学试剂（中国上海国药），脱脂奶粉（中国北京普利莱，货号P1622）， RIPA 裂解液（中国上海碧云天，货号P0013B），NR1 （Abyntek，货号A7677），NR2A（美国 proteintech，货号19953-1-AP），NR2B（美国proteintech，货号21920-1-AP），β-actin（美国proteintech，货号66009-1-Ig），HRP goat anti-mouse IgG（美国proteintech，货号SA00001-1），HRP goat anti-rabbit IgG（美国proteintech，货号SA00001-2），标准品丝氨酸（美国sigma，货号S0450000），外源性D-Ser 试剂（MCE 公司，货号HY-100808），甲酸（美国sigma，货号F0507），乙腈（美国sigma，货号34851），摇床（中国江苏其林贝尔，货号TS-1），台式冷冻离心机（中国湖南湘仪，货号H1650R），电泳仪（中国北京六一，货号DYY-6C），电泳槽（中国北京六一，货号 DYCZ-24DN），转膜仪（中国北京六一，货号DYCZ-40D），旋涡混合器（中国江苏其林贝尔，货号GL-88B），磁力搅拌器（中国雷磁，货号JB-13），精密PH 计（中国雷磁，货号PHS-3C），电子天平（美国双杰，货号JJ224BC），生物样品均质仪（中国杭州奥盛，货号BioPrep-24），SDZ-Ⅱ华佗电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），液质仪器（岛津，货号LC-MS-MS-8050）。

1.3 模型制备

选用大鼠大脑中动脉闭塞模型，制备方法参照Zea Longa 法［8］，使用颈总动脉插入线栓法。术后大鼠麻醉清醒予以评分，评分标准参照Zea Longa 的5分制神经行为评分标准：评分1-3 分者纳入实验，其余剔除。假手术组分离出血管后不插线。

1.4 腹腔注射

电针+D-Ser 组、模型+D-Ser 组：分别在插入线栓成功后30 min 按160 mg/kg 腹腔注射外源性D-Ser 试剂1 次。再按被试因素施加方法予以相应的处理。

1.5 电针干预处理

采取捆绑法固定大鼠，参照《实验针灸学》动物穴位图谱，电针心包经组、电针心包经+D-Ser 组在造模成功后24 h 后行电针治疗1 次，选取瘫痪侧心包经的天泉穴、曲泽穴为一组，内关穴、大陵穴为一组，进行电针治疗；选用华佗牌电针治疗仪，疏密波，输出电流为0.5-1 mA，频率为15 Hz，强度以局部组织轻颤为度，治疗30 min。其余各组仅捆绑固定30 min，不干预。

1.6 大鼠的行为学评分

大鼠的行为学评分参照孙敬芳《动物实验方法学》中的标准，在造模成功后6 h 和取材前分别进行2 次评定，最高分为11 分，分数越高，表示大鼠的运动功能障碍越严重，用于评价大鼠脑缺血后运动功能的损伤及恢复情况。

1.7 检测方法及指标

1.7.1 液相色谱串联质谱法检测缺血脑组织中D-Ser 含量提取样品，配制标准物质溶液，取标准物质母液，加水分别配制浓度为1、2、5、10、20、50、100 ng/mL 的标准物质溶液，过0.22 μm 滤膜，HPLC-MS/MS 分析；UPLC 条件：液相色谱型号：LC30；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm*2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A：0.1%甲酸水溶液，柱温：35℃；B：乙腈，流速：0.3 mL/min，进样体积：1 μL；质谱条件：模式：ESI，正离子模式分析，扫描模式：多反应监测（MRM），干燥气：氮气10.0 L/min，加热气：空气10.0 L/min，碰撞气：氩气270 kPa，雾化气：3.0 L/min，接口温度：200℃，DL 管温度：280℃，驻留时间：150 ms，加热模块温度：300℃，延迟时间：3 ms，接口电压：1.0 KV；进行实际样品检测，采取不同处理组织进行检测组织中丝氨酸的含量，组织中均检出含有不同含量。

1.7.2 Western Blot 蛋白质印迹法检测NR1、NR2A和NR2B 蛋白表达水平首先提取蛋白，剪取约0.025 g 组织样，经过冰上裂解、离心等处理，取上清加loading buffer 变性；制SDS-PAGE 胶，待胶凝固后，取marker 2 μL 置于第1 孔，20 μL 已变性蛋白置于剩余孔；开始电泳，电压恒定75 V，时间为130 min；按照分子量分别切胶，准备滤纸、NC 膜放入转膜缓冲液中，按“滤纸-NC 膜-胶-滤纸”的顺序以300 mA 恒定电流进行转膜；用1*PBST 洗膜1 次；用1*PBST 配制5% 脱脂奶粉，浸入膜后，室温封闭1.5 h；用1*PBST 将一抗按照一定比例稀释，将膜与一抗一起孵育过夜，次日室温放置30 min，1*PBST洗10 min，重复3 次；用1*PBST 稀释HRP 标记的二抗，将膜与二抗共同孵育1.5 h，1*PBST 洗15 min，重复3 次；最后用ECL 显色曝光，在凝胶成像系统成像。

1.8 统计学处理

所有数据均输入计算机，用SPSS 26.0 统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，当资料同时满足正态分布和方差齐性时，多组组间比较采用方差分析LSD 或SNK 法；满足正态分布，不满足方差齐性时，采用Games-Howell 法；当资料不符合正态分布时，采用非参数检验；当差值正态检验符合时，组内比较采用配对样本t检验；反之则采用配对样本秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的行为学评分

（1）处理前：与正常组、假手术组比，造模后各组的行为学评分均升高（P＜0.05），表明造模成功；与模型组相比，模型+D-Ser 组和电针心包经+DSer 组的行为学评分均升高（P＜0.05），表明外源性注入D-Ser 加重了大鼠的行为障碍。（2）处理后：与模型组相比，电针心包经组差异无统计学意义（P＞0.05），模型+D-Ser 组和电针心包经+D-Ser 组的行为学评分仍升高（P＜0.05）；与模型+D-Ser 组相比，电针心包经+D-Ser 组行为学评分无统计学意义（P＞0.05）。（3）组内处理前后比较：除正常组和假手术组外，各组行为学评分均略升高，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠的行为学评分比较（分，n=6，±s）Tab 1 Comparison of behavioral scores of rats in each group（scores，n=6，±s）

注：与正常组、假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

处理后0.000±0.000 0.000±0.000 7.000±0.632*7.500±1.225*8.333±0.817*#8.667±1.033*#组别正常组假手术组模型组电针心包经组模型+D-Ser 组电针心包经+D-Ser 组处理前0.000±0.000 0.000±0.000 6.667±0.817*6.500±1.049*8.000±1.265*#8.500±0.837*#

2.2 各组大鼠脑组织中D-Ser 含量比较

正常组与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常组相比，造模后各组的D-Ser 含量均不同程度增加（P＜0.05），模型+D-Ser 组增加最为显著；与模型组相比，模型+D-Ser 组的D-Ser 含量进一步升高（P＜0.05），而电针心包经组、电针心包经+D-Ser 组均无统计学意义（P＞0.05）；与模型+D-Ser 组相比，电针心包经+D-Ser 组的D-Ser 含量下降（P＜0.05）。见表2 及图1。

图1 各组D-Ser 含量Fig 1 D-Ser Content of Each Group

表2 各组大鼠脑组织中D-Ser 含量比较（±s）Tab 2 Comparison of D-Ser content in brain tissue of rats in each group （±s）

注：与正常组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05；与模型+D-ser 组相比，^P＜0.05。

D-Ser 246.365±72.304 252.030±22.940 496.540±11.553*428.733±55.838*645.430±61.863*#539.454±30.896*^组别正常组假手术组模型组电针心包经组模型+D-Ser 组电针心包经+D-Ser 组n 6 6 6 6 6 6

2.3 各组大鼠NR1 的蛋白表达比较

正常组与假手术组的NR1 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常组相，造模后各组大鼠的NR1 的蛋白表达均增强（P＜0.05），模型+D-Ser组最为显著；与模型组相比，电针心包经NR1 的蛋白表达明显降低（P＜0.05），模型+D-Ser 组的NR1蛋白表达相对升高（P＜0.05），电针心包经+D-Ser组则无统计学意义（P＞0.05）；与模型+D-Ser 组相比，电针心包经+D-Ser 组的NR1 蛋白表达下降（P＜0.05）。见表3 及图2。

表3 各组大鼠NR1 蛋白表达比较（±s）Tab 3 Comparison of NR1 protein expression of rats in each group （±s）

注：与正常组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05；与模型+D-ser 组相比，^P＜0.05。

NR1 0.173±0.008 0.185±0.030 0.520±0.017*0.272±0.012*#0.612±0.018*#0.502±0.035*^组别正常组假手术组模型组电针心包经组模型+D-Ser 组电针心包经+D-Ser 组n 6 6 6 6 6 6

图2 各组大鼠的NR1 蛋白表达Fig 2 NR1 protein expression of rats in each group

2.4 各组大鼠NR2A、NR2B 的蛋白表达比较

正常组与假手术组的NR2A、NR2B 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常组相比，造模后各组的NR2A、NR2B 蛋白表达均增强（P＜0.05）；与模型组相比，电针心包经组和电针心包经+D-Ser 组的NR2A、NR2B 蛋白表达均下降（P＜0.05），且电针心包经组的降低幅度大于电针心包经+D-Ser 组；模型+D-Ser 组的NR2A、NR2B 蛋白表达较模型组进一步增强（P＜0.05）；电针心包经+D-Ser 组的NR2A、NR2B 蛋白表达较模型+DSer 组减弱（P＜0.05）。见表4 及图3。

图3 各组大鼠的NR2A、NR2B 蛋白表达Fig 3 NR2A and NR2B protein expression of rats in each group

表4 各组大鼠NR2A、NR2B 蛋白表达比较（±s）Tab 4 Comparison of NR2A and NR2B protein expression of rats in each group（±s）

注：与正常组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05；与模型+D-ser 组相比，^P＜0.05。

NR2B 0.157±0.039 0.178±0.031 0.437±0.038*0.232±0.038*#0.592±0.026*#0.365±0.026*#^组别正常组假手术组模型组电针心包经组模型+D-Ser 组电针心包经+D-Ser 组NR2A 0.165±0.048 0.212±0.087 0.447±0.031*0.272±0.048*#0.577±0.008*#0.370±0.025*#^

3 讨论

缺血性中风发病初期主要是由于风、火、痰、瘀上阻脑络，闭阻神窍［9］。中医认为心主血脉，且为藏神之脏，在五脏六腑中的地位十分重要，被视作“君主之官”；脑由脑髓汇聚而成，故被称为髓之海，又是神明之所出，故称为“神明之府”，心脑共同主宰和统帅着人的生命活动和精神活动。两者在生理上和病理上均密切相关，互相影响。心主血脉、藏神的生理机能正常，心气充沛才能推动血液运行至脑腑，使脑髓得以充养。可见“神明藏于脑，发于心”，心脑相通共主神明，现代一些疾病也可反映两者的病理联系，例如“脑心综合征”。心包经为心主，能协助完成心主血脉、主神明之功，同时能“代心受邪”。心包经主脉所生病者，脉通血气，虽其未直接与脑相关，但是针刺心包经却能通过调理心气，促进气血的运行，使得气血上供于脑，濡养脑窍，从而治疗中风等脑部相关疾病。故心包经、心、脑部三者关系密切，已有临床研究［10］证实电针心包经穴对于脑梗死患者具有确切疗效。

NMDAR 是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，其兴奋与激活是脑缺血损伤机制中的重要靶点，当NMDAR 过度激活时，胞内Ca2+水平升高，致使兴奋性毒性和神经损伤，因此NMDAR 的活化状态对脑缺血后神经元损伤的进程具有重要影响［11］。NMDAR 是谷氨酸重要的离子型受体，但部分离子型谷氨酸受体（iGluRs）的激活并不完全依赖于谷氨酸，在GluN1/GluN2 NMDAR 上，甘氨酸或D-Ser与谷氨酸协同作用，作为强制性的共激动剂，调节NMDAR 的活性水平［12］。D-Ser 作为重要的神经胶质细胞递质，通过兴奋NMDA 受体实现调节突触传递、神经元兴奋性等。国外研究发现，D-丝氨酸给药3 h 后，D-Ser 的细胞内外浓度出现明显升高，提示外源性D-Ser 能对脑组织内D-Ser 产生影响，进而影响NMDAR 的活性［13］，但目前国内相关研究较少。

NMDA 受体主要由NR1、NR2（NR2A-2D）、NR3 （NR3A、NR3B）3 个主要亚基组成，其中NR1亚基是基本功能亚单位，NR2A 和NR2B 与谷氨酸的亲和力普遍强于NR2C 和NR2D，是重要的调节亚单位［14］。既往研究［11］［14］表明NR1 表达增加NMDA 诱导的兴奋性毒性；分布于突触外的NR2B，通过引起持续缓慢的Ca2+内流，致使Ca2+超载，发挥神经损害作用；而分布于突触内的NR2A则与之相反，发挥神经保护作用。NMDAR 不同亚基的表达与脑缺血病程所处时期密切相关，本研究中NR2A、NR2B 在1 d 的表达与既往研究［15］中MCAO 大鼠NR2A 和NR2B 蛋白和基因表达于急性缺血期显著增强相一致，致使胞内Ca2+超载，神经细胞死亡。

本次实验结果显示，造模后大鼠出现神经功能缺损症状，缺血脑组织中D-Ser 含量以及NR1、NR2A、NR2B 的蛋白表达均增加，二者呈正相关。在电针治疗1 d 后，各组大鼠的行为学评分并未见改善，一方面是由于急性缺血性卒中为一个动态的病理过程，急性期脑组织正处于缺血性脑水肿期，因此大鼠的行为学障碍仍在加重。另一方面，由于电针时间过短刺激量不够，而评分反而略高可能与急性期大鼠比较虚弱，捆绑、抓握等刺激因素亦可加重大鼠的整体行为障碍有关。本团队在前期多个时相点的研究中发现［6］电针心包经组的行为学评分自第3 天后才开始逐渐下降，表明电针具有累积效应。同时本实验发现急性期加入外源性D-Ser后，大鼠脑组织内的D-Ser 水平可因外源性D-Ser 的补充而增多，进一步增强NMDAR 活性，加重神经损害。而电针心包经组和电针心包经+D-Ser 组的D-Ser 含量呈下降趋势，并且NR1、NR2A、NR2B 的蛋白表达明显降低，再次证实电针心包经可减少DSer 含量，降低NR1、NR2A、NR2B 的蛋白表达水平。另外，对比同时段D-Ser、NMDAR 的表达水平发现，与模型组相比，1 d 时电针心包经组的NR1、NR2A、NR2B 蛋白表达即可明显降低（P＜0.05），先于D-Ser 的下调反应（P＞0.05）。考虑D-Ser 的合成释放涉及多个环节，与SR 密切相关，D-Ser 是体内的L-Ser 经过SR 消旋转化而来的，国外有研究发现［16］在SR 靶向缺失的小鼠的大脑皮层培养中，DSer 水平降低约85%，神经毒性明显减弱。同时导师团队的前期研究表明［5］电针心包经在可下调SR蛋白的表达，抑制D-Ser 的合成和释放。Wang 等［17］实验研究发现在局灶性脑缺血后的前4 d 内，SR 的表达无明显变化，缺血后第6～10 天缺血皮质中SR的基因和蛋白水平均出现延迟性降低，同一时期，同侧皮层的D-Ser 浓度也有所下降，表明颞顶叶皮层SR 表达和D-Ser 水平在局灶性脑缺血晚期出现延迟下降。结合前期研究［7］显示电针心包经组的D-Ser 含量于3 d 后始呈现稳定的下降趋势，而NR1、NR2A、NR2B 蛋白表达在1-3 d 明显下降，表明电针心包经的作用对D-Ser 的下调可能存在一定延迟性，由此推测NR1、NR2A、NR2B 对于电针的调节应答可能更为敏感。

综上，体外注射外源性D-Ser 在急性期可加重兴奋性毒性，电针心包经穴可减少急性期MCAO 大鼠脑组织中D-Ser 含量，降低NR1、NR2A、NR2B 的蛋白表达水平，抑制NMDAR 活性，发挥促MCAO大鼠神经修复的作用，并且NR1、NR2A、NR2B 的表达下降趋势较D-Ser 更明显。

作者贡献度说明：

袁柳媚、娄必丹：全程参与、指导实验操作并撰写论文；夏云、卢小叶：饲养动物，取材，参与论文撰写；刘蕾、周颖：参与动物造模和实验操作。

所有作者声明不存在利益冲突关系。