采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞活性及瞬时外向钾电流观察

何水静，徐瀚哲，胡棣文，孟宪睍，李辛一，王腾，胡丹，黄燕

1 武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，武汉 430060；2 武汉大学第一临床学院

目前已有许多实验［1-2］证明，心肌细胞离子通道异常与心血管疾病之间关联紧密。认识各种正常生理或异常病理状态下心肌细胞某种离子通道的特性，尤其是其结构和功能的变化，在研究疾病发病机制、相关药物作用以及新型药物研发等方面都起着至关重要的作用［3-5］。膜片钳技术为心律失常以及心脏电生理研究中不可或缺的方法［6］。同时，钙成像以及单细胞测序等技术在近年来的心脏电生理研究中也占据了重要地位。单个心肌细胞常被应用于上述试验中，因此如何利用经济、简便的方法获得适用于这些实验研究的心肌细胞尤为重要。当前，单个心肌细胞的获取方法主要有原代细胞培养、急性分离等［7］。新生大鼠心肌细胞的分离和培养技术已相当稳定成熟［8］，但成年大鼠心肌细胞的体外培养不仅操作时限长且操作复杂，对细胞外环境要求高，体外培养不易存活，且培养出的细胞产量低，再生能力差［9］。培养细胞与急性分离所得成熟细胞在形态和功能等方面存在着较大差异，许多实验培养新生鼠未成熟的心肌细胞来进行后续研究所得的结论与成熟心肌细胞做出来的结论并不相符。直接分离成熟心肌细胞用于实验称为急性分离，目前常用的急性分离方法有机械分离和酶分解法。急性分离细胞更接近生理状态，利用急性分离的心肌细胞所得实验结果更具临床应用价值，而机械法分离心肌细胞难以避免损伤心肌细胞膜。酶解法分离细胞是1969年KONO［10］首先报道的，为心肌细胞急性分离的最常用方法。现已有许多实验对该种方法进行了研究，但所得细胞质量不一。本研究通过改进分离过程中所使用的装置、材料及方法，形成一种简便而经济高效的成年大鼠心肌细胞分离方法即胶原酶Ⅱ循环灌流消化法，采用此方法能分离到舒缩状态良好且耐钙，功能稳定的单个细胞，并能用来记录心肌细胞离子通道电流。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 6～8周的健康成年SD大鼠，雌雄不限，体质量150～200 g，均购买于北京维通利华公司。实验遵循《湖北省实验动物管理条例》中的相关规定。主要试剂：胶原酶Ⅱ（COLLAGENASE，TYPE 2），4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）购自Sigma 公司，氯化钠（NaCl），氯化钾（KCl）等试剂均为国产分析纯。无钙台式液：NaCl 135 mmol/L；KCl 5.4 mmol/L；氯化镁（MgCl2）1.0 mmol/L；磷酸二氢钠（NaH2PO4）0.33 mmol/L；HEPES 10 mmol/L；葡萄糖（Glucose）10 mmol/L。溶液使用前用氢氧化钠（NaOH）调pH 至7.35。细胞保存液：无钙台氏液+ 牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL），所有溶液在使用前用95% O2+ CO2饱和约30 min。记录瞬时外向钾电流的电极内液：KOH 130 mmol/L； KCl 15 mmol/L； MgATP 5 mmol/L； CaCl21 mmol/L； Lglutamic acid 130 mmol/L； MgCl21 mmol/L； NaCl 5 mmol/L； EGTA 5 mmol/L； HEPES 10 mmol/L；PH用KOH 调pH至7.35。记录瞬时外向钾电流的细胞外液：NaCl 138 mmol/L； MgCl21.0 mmol/L； KCl 5.4 mmol/L； CaCl21.8 mmol/L； HEPES 10 mmol/L；Glucose10 mmol/L； nifedipine 0.02 mmol/L；PH 用NaOH 调pH 至7.35。主要仪器：Langerdorff 灌流装置（自制，如图1）；恒流泵；恒温水浴锅；倒置显微镜（日本olympus）；电极拉制仪P-97（美国sutter）；膜片钳（德国HEKA）。

图1 自制Langerdroff装置

1.2 心肌细胞的分离 采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法。提前打开Langerdorff 灌流装置中的加热装置，使Langerdorff 系统温度维持在37 ℃。配制无钙台式液1 000 mL，加热同时通氧气30 min 后，调pH至7.3～7.35。分离细胞过程中所需的溶液分为A、B、C 杯；A 杯：100 mL 无钙台氏液 + 20 mg 乙二醇双四乙酸（EGTA），调pH 值至7.35；B 杯：100 mL 无钙台氏液；C 杯：60 mL 无钙台氏液 + 30 mg BSA +12 mg 胶原酶Ⅱ。另外量取100 mL无钙台氏液冰浴通氧备用，剩余台氏液恒温水浴通氧备用。用75%乙醇反复冲洗Langerdroff 灌流装置3～5 遍后，再用去离子水冲洗3～5遍，再通准备好的无钙台氏液，灌流速度调节至7～8 mL/min之间。

取SD 大鼠称重，腹腔注射肝素（200 U/kg），10 min后腹腔注射3%戊巴比妥钠（60 mg/kg），充分麻醉后固定于鼠板上，用止血钳提起胸壁皮肤，组织剪剪开皮肤后，提起剑突，自剑突沿肋缘下剪开胸壁。充分暴露心脏后，弯镊托起心脏及部分肺组织，眼科剪于心脏根部保留主动脉1～2 cm剪下心脏，立即放入预冷的氧饱和无钙台氏液中，快速清洗，修剪肺及其他结缔组织，保留心脏及1 cm 左右的主动脉，迅速行主动脉插管，动脉夹固定。

确认Langerdroff 装置已打开且无气泡，将插管接于灌流装置灌流口处，细线于主动脉第一分支根部固定。灌流过程中，所有的灌流液均需持续通氧。参照并改进文献［11］方法，先以预先恒温水浴且氧饱和的无钙台氏液灌流冲洗干净残留血液，然后依次灌流A 杯约5 min，B 杯3～5 min，C 杯酶液灌流至心脏疏松膨胀变软约20 min。在C 杯酶液灌流消化过程中，为了提高胶原酶的活性，分3 次加入60 μL 20 mmol/L 的CaCl2溶液；消化酶液可循环使用。同时密切观察心脏形态，消化至心脏半透明，明显胀大蓬松时停止消化，此时亦可观察到酶液滴速增快；也可取少量心室表面组织于镜下观察，若有散在单个细胞即可停止消化，此时为心室肌细胞消化终点。

取下心脏于保存液中清洗。由于心房肌细胞较心室肌细胞难于消化，在心室消化终止后，剪取左右心房，置于装有酶液离心管中，37 ℃通氧水浴，继续消化约30 min。待心房消化成絮状，取出离心管。将剪取的左右心室、室间隔的组织块以及消化结束的心房组织块，分别加入50 mL 的烧杯中，加少量细胞保存液，用眼科剪将心肌块剪碎至1 mm³大小，巴氏管轻轻吹打1～2 min，将其吹散。烧杯中加保存液至50 mL，制成细胞悬液，37 ℃水浴通氧孵育，而后静置10 min分杯。将静置后的上清液倒入另一烧杯中，得到第1 杯细胞悬液，再次剪碎沉淀的组织块，吹打分散，加保存液至50 mL，37 ℃水浴通氧孵育，静置。重复上述步骤，得到第2、3、4杯细胞悬液，吸取一滴于倒置显微镜下观察活细胞比例及细胞形态、状态、横纹、折光性以及细胞舒缩状态。用20 mmol/L 的CaCl2给细胞悬液复钙3 次，每10 min一次，至保存液中钙浓度达到1 mmol/L，室温保存备用。

1.3 分离的心肌细胞瞬时外向钾电流记录 用巴士滴管吸取1～2 滴室温保存的细胞悬液，置于膜片钳记录系统细胞槽，静置1～2 min，待细胞贴壁后，灌流预先氧饱和的细胞外液。选取形状规则，横纹清晰的细胞进行记录。玻璃电极采用两步拉制法，控制入水电阻2～5 MΩ。低倍镜下，移动电极，使电极入液，补偿液接电位，待电极接近细胞表面时，切换至高倍显微镜，调整电极位置，使电极位于细胞中央，缓慢移动电极，使其轻压细胞表面，此时电极阻抗轻微升高。给予负压轻轻抽吸，可见电极封接阻抗迅速上升至GΩ，GΩ 封接稳定3～5 min，补偿快电容，稍加负压使细胞破膜，补偿慢电容和串联电阻，记录瞬时外向钾电流［12-13］。

2 结果

2.1 分离的心肌细胞形态和活性 分离获取的细胞悬液在显微镜下约90%细胞为杆状、边缘锐利、横纹清晰，无空泡，有强的折光性，舒缩规律，为活的细胞。心室肌细胞较短、宽；心房肌细胞弯曲细长；另有10%的静止细胞，呈不规则圆球状，边缘模糊，为死细胞。逐步复钙后仍有60%～70%的细胞存活，边缘整齐、横纹清晰、折光性强、无收缩，为耐钙细胞（图2）。

图2 酶消化法分离的单个心肌细胞

2.2 分离的心肌细胞瞬时外向钾电流 电压钳模式下，瞬时外向钾电流记录方案：钳制电压-80 mV，给予-50 mV 持续40 ms 的预刺激使钠通道失活，继续给予-50～ + 60 mV 的系列脉冲，每一脉冲持续500 ms，阶跃10 mV，可记录到一外向电流，在-40 mV 左右被激活，随膜电位去极化程度增加而增大，即为瞬时外向钾电流。原始电流记录图见图3A，电流密度-电压（I-U）曲线图见图3B。

图3 全细胞膜片钳记录的瞬时外向钾电流

3 讨论

心肌细胞为研究心脏结构、功能、代谢以及心血管疾病病理生理变化、药物作用机制以及药物研发的重要工具，因此如何获取高质量的心肌细胞至关重要。30年前，国内学者［14］率先分离出成年大鼠单个心肌细胞，为后续实验利用更接近生理状态的成熟心肌细胞进行研究提供了机会［15］。同时技术的发展也对急性分离心肌细胞的操作提出了更高的要求——不再仅着眼于分离即刻的杆状率，更要求其在后续操作中始终保持较好的细胞活性以及较高的存活率直至实验结束。我们经过探索，摸索出一种简单、高效的急性心肌细胞分离方法——胶原酶Ⅱ循环灌流消化法，该分离方法获取的心肌细胞记录到了稳定良好的离子电流，可用于心脏电生理特性的研究以及心血管疾病药物开发的探索。

据文献［16-17］报道，应用Langendorff 灌流分离心肌细胞有恒流和恒压两种模式，恒流模式可以通过监测灌注压力判断是否消化完全，从而优于恒压模式；我们用自制的恒流Langendorff 灌流装置进行心脏灌流，所有的液体从装置下部通过恒流蠕动泵逆行至弯管，这样既可以防止气泡流入主动脉，又可通过恒流泵使酶液循环利用。以往的研究［15，18，19］主张在消化过程中联合胶原酶与蛋白酶以提高消化效率，但同时胶原酶有较强的细胞膜损伤作用，我们在分离过程中尝试单用胶原酶消化，发现活细胞产出率高、获得的细胞形态规则、细胞膜完整。也有学者［20］在第一步灌流含钙台式液，来恢复心脏跳动，减少心腔内的残余血；我们认为，心脏离体后尽可能缩短修剪心脏时间，以及用手轻轻按压心脏可以帮助排空心腔残余血，这样主动脉插管后悬挂于Langendorff 灌流装置上心脏仍处于跳动状态，直接灌流无钙台式液就可以排空残血，同时减少能量代谢。

本研究通过总结前人的经验和不断的尝试，总结出一套简单可行且经济高效分离成年大鼠全心肌细胞的方法（胶原酶Ⅱ液消化法），在探索过程中主要得到了以下经验：首先，本实验所用方法不需使用蛋白酶E，同时通过延长心房消化时间这一简单操作即可成功分离出高杆状率高活性的全心肌细胞，操作简便经济。其二，使用自制的Langerdorff 心脏灌流装置，灌流液通过恒流泵由底部泵至灌流装置，流速可控，避免灌流速度过快心脏内部压力过高或消化过度破坏心肌细胞本身。同时，酶液可循环重复使用，既保证了消化效果，同时节约了成本。其三，消化时，可将酶液滴于心脏表面使心脏保持润湿，保证内外层心肌达到消化同步。其四，与传统四步法相比，我们第一步直接用无钙台氏液灌流，既能起到正常台氏液所起的作用，冲洗干净残余血液，使得细胞之间的桥接得以松解，同时可避免正常钙台氏液灌流所引起的能量消耗，提高了心肌细胞的存活率。另外，本实验过程中加入了BSA，可保护细胞膜免受酶液损伤；使用细胞保存液，延长了细胞的存活时间。

本实验中需要注意以下事项：第一，对大鼠心脏进行修剪及主动脉插管过程需尽可能迅速。主动脉插管位置需适当，针尖位于主动脉瓣以上头臂干动脉以下，保证灌流液顺利进入冠状动脉。操作的整个过程应将心脏置于预先冰浴通氧的无钙台氏液中，整个过程最好控制在3 min 之内，以降低心脏的能量消耗。第二，A 杯（无钙台氏液 + EGTA）的灌流时间控制在5 min左右将心脏残血冲洗干净即可，不宜过长，否则易使得细胞不耐钙。第三，关于消化程度的判断是本实验的重点也是关键点之一。消化不充分和消化过度都会损害细胞，不利于后续操作。消化过程中密切观察心脏外形及手感的变化可帮助判断消化终点。心脏在通酶液前较软，酶液消化后开始变硬，消化终点时又变软，且心脏发白，体积显著增大呈球形，组织蓬松，流出的酶液变得黏稠时，结合灌流时间，可判断其已到达心室消化终点，应当立即停止消化。由于心房肌的消化更为困难，可将其单独剪下，继续消化。

总之，采用胶原酶Ⅱ匀速灌流并重复使用的方法分离成年大鼠心肌细胞，细胞产出率高、耐钙且活性好，能很好满足后续实验要求。但本实验仍有不足之处，本方法所用胶原酶ⅡLangerdorff 逆主动脉消化法技术及装置要求较高，且消化下来的为整个心脏的细胞。若实验只需要局部心肌如动脉结扎缺血处理的心肌细胞，利用该方法仍需要消化整个心脏，较为浪费。且该方法只适用于实验，难以用于获取人体心肌细胞。目前本研究团队正在尝试是否可以利用其他装置固定局部心肌进行胶原酶Ⅱ循环消化，既可以解决分离细胞需要消化整个心脏的问题，同时也避免了直接使用酶解法无法控制酶渗透消化时间，导致心肌细胞破坏严重的问题。