用于细菌生物膜感染治疗的纳米纤维的研究进展

赵树颖，张莹洁，李 彦,b，王 璐,b

(东华大学,a纺织学院；b纺织面料技术教育部重点实验室，上海 201620)

近年来，生物膜感染成为医疗卫生领域中的一个十分具有挑战性的问题。有报告显示，每年因生物膜感染而患病或死亡的人数高达100万人，给患者身心健康和社会经济造成严重的损害[1]。生物膜由细菌及其自身分泌的胞外聚合物(Extra-cellular polymeric substances，EPS)组成，EPS包围并保护细胞，其主要成分包含多糖、蛋白质、脂质和细胞外DNA等，是细菌生存的直接环境，在调控细菌信息交流以及增强细菌对不利条件的抗性等方面起到重要作用[2-3]。EPS的形成与细菌群体感应(Quorum sensing，QS)机制密不可分。QS是指菌体自身产生化学信号并且感知其相应信号浓度变化，进行细菌种间或种内信息交流，从而调节细菌群体行为的一种特殊调控系统[4-6]。EPS的存在与细菌QS机制使生物膜相比于浮游细菌表现出明显不同的形态特征和生理作用，也导致了细菌对宿主免疫系统的天然抗性和对抗生素的耐药性，给治疗带来重重困难。根据柳叶刀评估模型，2019年与细菌耐药性感染有关的死亡人数达到了495万，预测推断，到2050年，细菌耐药性感染每年可能导致1000万人死亡，如果不加以控制，可能会使许多细菌病原体在未来更加致命[7]，因此迫切需要有效的手段清除生物膜，以解决细菌耐药性感染问题。

依托静电纺丝技术制备的纳米纤维具有高比表面积，能够作为载体为抗菌剂的负载提供大量活性位点。与此同时，静电纺丝技术可纺的原料范围广，纤维形貌易于调控，表面可设计性强，为纳米纤维的功能性拓展提供可能，因此在对抗细菌生物膜中逐渐崭露头角[8-10]。本文对细菌生物膜的形成过程及危害以及治疗方法等进行阐述，着重介绍了目前采用纳米纤维应对细菌生物膜的策略，以期给细菌生物膜治疗及干预提供一定的启示与借鉴。

1 生物膜的形成及危害

1.1 生物膜形成过程

细菌生物膜可以在任何生物或非生物表面形成，其通常是由一种或几种不同的细菌物种组成。细菌之间通过QS机制进行信息交流。细菌生物膜的形成是一个动态的、复杂的、循环的过程，如图1所示，主要涉及以下几个阶段[11-14]：

图1 生物膜的形成过程

a)可逆的附着阶段(浮游阶段)：浮游细菌通过与生物或非生物表面的弱相互作用(如表面电荷、范德华力、静电力等)附着在表面上，此时由于作用力微弱，附着是可逆的；b)不可逆的附着阶段：细菌主要通过分泌黏附素和黏附蛋白，将自己锚定在表面上。之后细菌通过合成QS信号分子进行基因调控，当自诱导物分子表达达到临界浓度，就会在微生物菌落表面形成EPS，从而保护细胞并将其附着于物体表面；c)细菌增殖阶段：EPS形成后，细菌通过QS机制传递信号，启动相关基因，增殖形成生物膜微菌落；d)生长和成熟阶段：此时，细菌由于合成了EPS而使得尺寸增加，最终形成三维立体的菌落，具体形态主要取决于细菌种类。最终生物膜的体积以EPS为主，约占90%，细菌占10%。大量EPS的产生有助于保护生物膜，并提高其对抗菌作用的耐受性。存在于成熟生物膜复杂结构内的细菌中的基因表达与浮游细菌的截然不同；e)脱落和扩散阶段：在最后阶段，细胞以浮游形式从成熟的生物膜中释放出来，定植于其他表面，再次开始生物膜的下一个生命周期。细菌恢复到浮游状态有几个原因：缺乏营养物质或者有毒残留物的积累导致细菌需要寻求更好的环境、机械紊乱、酶降解EPS，表面活性剂的产生等[15]。

1.2 生物膜的危害

据估计，地球上40%至80%的微生物生物量与生物膜有关。易形成生物膜且会导致耐药性相关死亡的六大病原体包括大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)，均给人类健康带来了严峻的挑战[16]。据美国国立卫生研究院报道，80%以上的微生物感染和60%以上的医院感染是由生物膜引起的[17]，其危害主要表现在对植入式医疗器械造成的感染以及引发病患体内的慢性感染。

植入式医疗器械包括骨科植入物、牙科种植体以及导管、人工心脏瓣膜等各种植入人体的器械[18]。植入物感染主要发生在手术过程中，手术室的局部环境以及患者皮肤上和患者体内的细菌是感染因子的重要来源。Gristina等[19]最早提出表面竞争学说，探讨的是细菌和宿主细胞在植入物表面竞争黏附、增殖和定植。如果宿主细胞赢得“比赛”，细胞和骨科植入物表面之间就会形成稳定的界面，植入物与骨组织之间直接接触，并形成无纤维结缔组织包围的界面层，即成功完成骨整合。但如果发生相反的情况，细菌更早地定植于植入物表面，形成不可逆的附着，进而会形成生物膜，导致机体自身免疫无法对抗，最终导致植入物感染[20]。植入物感染是一种严重的手术并发症，一旦发生，只能通过移除植入设备、手术切除感染组织并结合长期全身抗生素来治疗，不仅治疗周期漫长痛苦，还会给患者带来相当大的经济负担，严重情况下甚至会导致截肢和死亡[21]。

生物膜引起的慢性感染主要包括慢性伤口感染、慢性呼吸道感染以及慢性中耳炎等，其中，最常见的是慢性伤口感染[22]。皮肤是人体的一道强有力的保护屏障，一旦受损就会启动高度复杂、动态的愈合机制[23]。正常的伤口在2～3周内可以自发愈合，其愈合过程涉及血细胞，结缔组织，实质细胞，细胞外基质和可溶性介质，如细胞因子和生长因子等的相互作用，主要包含的阶段有止血期、炎症期、组织增殖期和组织成熟或重塑期[24]。相较于正常愈合的伤口，慢性伤口通常在炎症阶段停滞不前，进而导致愈合无法在一个月内完成，研究表明，造成该愈合阻滞病症的原因80%与细菌生物膜有关[25]。慢性伤口生物膜由多个菌群组成，并通过EPS进一步结合在一起，通过不断与宿主免疫系统的成分(包括嗜中性粒细胞，巨噬细胞和炎性细胞因子)相互作用来促进长期炎症[26]。例如，S.aureus生物膜可以通过显著降低促炎细胞因子和趋化因子的表达水平来减弱传统的宿主炎症反应，从而阻碍巨噬细胞侵袭[27]。

2 基于纳米纤维的生物膜治疗方法

生物膜细菌相比于游离细菌有更复杂的形态结构与生理作用，EPS的屏障作用和细菌的信号系统是生物膜治疗过程中最大的阻碍，因此预防生物膜的形成、分解或靶向EPS以及抑制细菌信号系统成为生物膜治疗的关键。在预防生物膜形成方面，目前最常用的方法是通过在植入物表面涂覆抗生素以及各种有机或无机抗菌剂来形成抗菌涂层[28]。但是由于这种方法功能单一，忽视了促进组织黏附以及避免细菌定植的重要作用，并且存在生物稳定性或耐久性有限的缺点。而针对已形成的生物膜，传统的治疗方法包括物理清创、负压法以及使用抗生素等[29]。物理清创法会给患者带来很大的痛苦，同时未愈合的组织也面临再次感染的风险。负压法使用后可能导致肉芽组织过度增生，从而导致明显的疤痕。常规抗生素治疗生物膜的效果不理想，能够治疗生物膜的新型抗生素价格昂贵且往往伴随着更大的心肾毒性[30]。

静电纺丝技术是一种优秀的纳米纤维制备方法。静电纺丝技术具有纤维直径可调可控、操作方便、价格低廉、对环境无污染、材料范围广等优点，是制备连续纳米纤维结构材料的代表性技术[31]。通过在纺丝过程中将抗菌剂与聚合物共混或是纺丝结束后对纳米纤维进行功能化处理，如共价聚合物接枝、等离子体处理等技术，可以得到具有抗生物膜特性的纳米纤维[32-33]。纳米纤维的制备以及在细菌生物膜感染处的应用如图2所示。同时，功能化的纳米纤维可以实现多种治疗方法的协同，以应对细菌生物膜产生的耐药性，是一种极具前景的生物膜治疗策略。

图2 纳米纤维的制备及在细菌生物膜感染处的应用示意

2.1 防止生物膜形成

生物膜的形成是从细菌附着到表面开始的，细菌的黏附主要是通过与表面的弱相互作用、细菌自身鞭毛等的形态结构、分泌黏附蛋白等方式实现的，因此控制上述过程成为设计防黏附表面的关键。此外，通过抑制EPS的分泌进而防止形成成熟生物膜也是一种有效的生物膜治疗方法。

2.1.1 防止细菌黏附

在生物膜形成的第一阶段，细菌通过静电相互作用和疏水相互作用黏附在植入物表面。细菌在这个阶段的初始黏附是生物膜形成的诱因，抑制初始细菌黏附是解决植入物诱导感染问题的极好策略[34]。表面形貌，粗糙度，亲、疏水性和表面能都被认为在细菌的初始黏附、蛋白质的非特异性吸附以及随后的细菌定植和生物膜形成中起着至关重要的作用[35]。相关文献中材料特性对细菌黏附的影响归纳如表1所示。

表1 材料特性对细菌黏附的影响

近年来，等离子体处理作为一种高效技术被用于聚合物表面改性，而这种方法的一个重要优点是能够通过改变一些等离子体处理参数来调控聚合物的表面性质，如化学结构、形貌、亲水性和表面电荷等。Czapka等[40]认为S.aureus生物膜在亲水性表面形成效率更差，通过使用非热等离子体对含有亚甲蓝的醋酸纤维素纳米纤维进行表面改性，降低了其接触角，得到亲水的纳米纤维。该作者测试发现，未经等离子体处理的纳米纤维表面S.aureus生物膜数量为每毫克纳米纤维中有1.585×108个细胞，而经过等离子体处理的表面每毫克纳米纤维中有1.25×106个细胞。这种纳米纤维用于植入物涂层，辅助以光动力疗法，既能有效防止生物膜形成，又能杀灭已形成的生物膜。经光照180 min后，S.aureus生物膜减少了(99.99 ± 0.3)%。此外，由于两性离子结构上的优势，通过结合水分子可以在材料表面形成一层致密的水化层，因而在防止细菌黏附方面也起到了显著的作用。Ma等[41]通过将光敏剂3，3′，4，4′-二苯甲酮四甲酸二酐和两性离子甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)结合到聚乙烯醇(PVA)与聚乙烯复合的纳米纤维上来制备防止细菌黏附材料。接枝的SBMA两性离子聚合物部分带来了强大的防污性能，通过荧光共聚焦显微镜分析可明显观察到细菌黏附减少，与未接枝两性离子的纳米纤维相比其E.coli生物膜的荧光信号减少了约35%。这种方法可以通过纤维膜与蛋白质的相互作用防止生物膜的形成，是医疗器械表面防污杀菌涂层的优秀选择。

除了构建防污抗细菌黏附的功能表面之外，通过调节纳米纤维的结构特征及形态，尤其是纤维直径，也可在细菌黏附和随后的生物膜形成中发挥重要作用。Abrigo等[42]通过研究E.coli、PA、S.aureus与聚苯乙烯纳米纤维的相互作用，发现纤维直径会影响细菌黏附，增殖和形成菌落的能力，其主要取决于细菌的大小和形状。当纤维直径接近细菌大小时，增殖率最高。这主要是由于纳米纤维诱导杆状细菌的构象变化，限制定植过程并诱导细胞死亡。这一研究结果显示了通过调控纤维尺寸作为控制细菌黏附和扩散的工具的可能性。同时通过这种方法先吸引细菌黏附，再协同其他杀菌方式，为有效消除生物膜提供了一种可行的方案。

2.1.2 防止EPS形成

生物膜形成的一个重要阶段就是细菌在信号分子的作用下分泌EPS包围并保护细胞，进而增殖成熟形成生物膜，因此EPS的形成对生物膜的最终成熟至关重要。根据表面竞争学说，如果宿主细胞能更早地在植入物表面定植、增殖，那么细菌即使黏附在表面也不能分泌EPS形成生物膜而造成植入物感染。同时，成纤维细胞可以促进炎症过程以及抑制细菌分泌金属蛋白酶，从而促进伤口愈合。因此设计能增强成纤维细胞扩散的表面拓扑结构也是防止生物膜形成以及促进慢性伤口愈合的优秀策略。成纤维细胞对表面凹槽高度敏感并沿其排列，微凹槽和纳米凹槽对成纤维细胞排列和增殖有重要的影响。Ferraris等[43]通过研究发现凹槽的宽度应大于 100 nm，但小于70 μm，深度高于35 nm，距离应小于2 μm，以获得成纤维细胞的排列及其连接。此外，表面粗糙度应低于0.2 μm，以限制细菌污染。同时将具有良好的生物相容性和生物降解性，支持成纤维和成骨细胞生长和黏附的角蛋白纳米纤维沉积到具有纳米凹槽的钛板表面，以促进细胞的黏附增殖，研究证明相比于纳米凹槽的形貌刺激，角蛋白纳米纤维的化学刺激对细胞的排列影响更大，是一种促进成纤维细胞扩散增殖的有效材料。但研究结果表明，由于角蛋白的抑菌效果并不明显，导致生物膜去除效果不够理想，S.aureus数量减少了2 log CFU/g。进一步研究中，Cochis等[44]在角蛋白纳米纤维表面富集银，一方面能提供细胞亲和的表面，促进成纤维细胞黏附和扩散，另一方面富集的银颗粒可发挥抗菌功效。测试结果表明银富集的角蛋白纳米纤维能有效减少细菌定植，S.aureus生物膜72 h内定植量减少超过80%，研究人员还尝试了将其用于牙科植入物涂层，验证其能有效减少因生物膜感染而导致的种植体周围炎。

2.2 靶向EPS基质

正如前文所述，EPS基质包裹在细菌外部，形成了一道天然的物理屏障，是细菌的保护伞，会导致药物难以渗透进生物膜内部从而有效作用于菌体，因此EPS基质是导致细菌耐药性的一个重要原因。其次，EPS构成复杂，其中包含的蛋白酶等物质可以水解抗生素，使之在进入菌体之前就失活，抗生素由于无法有效地到达菌体部位，不能起到杀死细菌的作用[45]。因此，促进药物渗透以及促进EPS基质降解是有效消除生物膜的重要手段。

2.2.1 穿透EPS基质

穿透EPS基质，从而有效将药物渗透进菌体是消除生物膜的一个重要方法。几十年前，微针的概念首次被提出并用于药物递送领域，微针贴片很快成为以微创方式将抗菌剂输送到真皮的有前途的工具[46]。近年来已有研究通过将纳米纤维与可溶解的微针阵列集成在一起，作为抗菌递送系统用于细菌生物膜治疗。Su等[47]通过将含有W379肽的聚乙烯吡咯烷酮微针阵列固定到纳米纤维表面，开发了Janus型抗菌敷料(见图3)。结果表明与游离药物相比，微针贴片可以更有效地递送抗菌肽，在离体人体皮肤模型中建立了PA/S.aureus混合生物膜，每24 h更换一次敷料，3次更换敷料后，生物膜被彻底清除。在进一步的研究中，该课题组通过同轴静电纺丝技术开发了一种由可溶解的微针和纳米纤维组成的双相支架作为抗菌剂递送系统，用于同时递送AgNO3、Ga(NO3)3和万古霉素这3种抗菌剂的不同组合，以起到协同抗菌的作用[48]。研究结果显示，在使用单一抗菌剂负载的双相支架时，每36 h更换1次双相支架，3次更换后S.aureus生物膜被彻底清除；而在3种抗菌剂共同负载的双相支架上，第2次更换后S.aureus生物膜便可被完全清除。同时在含3种抗菌剂的双相支架处理创面 1次 48 h后，细菌就无法检测到，说明一次处理后生物膜被清除。通过3种不同抗菌机制的抗菌剂的协同作用，可以大大减少敷料更换次数，给患者带来便利。

图3 纳米纤维和微针阵列组成的Janus型抗菌敷料及其抗生物膜性能示意

2.2.2 降解EPS基质

细菌实现生物膜扩散的主要机制之一是产生作用于EPS基质中各种成分的胞外酶，因此将其外源性添加入生物膜中，可以通过降解EPS基质中特定的成分从而导致生物膜的主动扩散[49]。在使用酶分散生物膜时，常见的靶标是EPS中的主要成分蛋白质和多糖，通过破坏其的结构来破坏EPS的物理完整性。蛋白酶(包含蛋白酶K、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等)就是一种可以作用于生物膜中蛋白质的酶[50-51]。然而天然酶多受限于稳定性差且易失活等不足，使其应用受限，以纳米纤维作为载体，不仅可以提高酶的负载率，并且有助于活性的维持。Park等[52]制备了含有铜(Cu)和α-胰凝乳蛋白酶的聚乙烯醇/聚丙烯酸(PVA/PAA)纳米纤维，并且发现PVA/PAA-Cu纳米纤维可以增强水溶液中α-胰凝乳蛋白酶的稳定性，三次循环实验中，每次都有24%的蛋白质被稳定降解。分散素B(DB)是一种糖苷水解酶，能够降解EPS中的多糖。Piarali等[53]将合成抗菌肽Amhelin与DB共价偶联到聚羟基脂肪酸酯纳米纤维中，测试结果显示其对S.aureus生物膜抑制率达到了83%。通过DB的EPS降解作用结合抗菌肽的杀菌作用，可以有效消除生物膜，为伤口敷料的制备提供了一种可行的方案。

除酶降解措施外，光动力疗法因其非侵入性、灵活性且不会引发细菌耐药的风险，近几十年来在生物膜治疗领域显现出独特的优势。研究表明，光动力疗法通过可见光激活光敏剂产生ROS，ROS不仅通过对细菌细胞产生超强氧化反应使之失活，还可攻击EPS基质使其降解，从而起到消除生物膜的作用[54]。Beirao等[55]首次验证了光动力疗法对PA生物膜中多糖的降解作用，他们发现在阳离子卟啉未经光照的情况下使EPS中多糖降低了30%，而光照后多糖降低了80%，证实了光动力疗法可以对EPS造成破坏。Jiang等[56]制备了一种可见光响应水凝胶纳米纤维膜，通过细乳液合成共轭微孔聚合物纳米粒子作为光敏剂，将其加入PVA纳米纤维中，在可见光的照射下产生ROS，用作可消除细菌生物膜的伤口敷料。研究结果显示，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌溶液中孵育且在可见光进一步照射下的敷料24 h后无生物膜形成，而没有可见光照射的一组对生物膜的形成没有抑制作用。Khalek等[57]将亚甲基蓝和环丙沙星加入静电纺醋酸纤维素/聚环氧乙烷纳米纤维中，经过635 nm光照可以产生ROS，通过抑制金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌和铜绿假单胞菌生物膜来加速感染性伤口的愈合。Shi等[58]将没食子辛酸酯(OG)作为光敏剂固定在纳米纤维上，通过蓝光照射诱导产生ROS，消除荧光假单胞菌生物膜。当OG浓度为0.4 mmol/L，照射 90 min 时，荧光假单胞菌生物膜减少了79%。与对照组相比，细菌生物膜的三维结构和EPS基质的完整性受到破坏，细菌细胞塌陷和大细胞质组分泄漏，最终细菌死亡。光动力法通过产生ROS攻击相邻的各种分子，包括EPS基质、细菌细胞膜上的脂质、蛋白质以及细菌内部的DNA等，使细菌难以产生耐药性，在食品和医疗卫生领域具有广阔的应用前景。

2.3 抑制信号分子

生物膜是微生物的聚集性群落，可以由同种的微生物组成，但大多数情况下是不同种微生物的集合体，细菌之间通过信号分子进行通信。通过QS机制，细菌可调节生物膜性状，使之灵活适应不利环境。QS机制通过自诱导物分子进行细胞间通信，在将细菌群落转化为成熟生物膜方面起了重要的作用[59]。使用群体感应猝灭酶灭活群体感应自诱导物是消除生物膜的有效策略。酰化酶(AC)是一种众所周知的群体感应猝灭酶，可以通过切断内酯环和酰基链之间的酰基酰胺键来降解N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)自诱导物。Lee等[60]将AC固定在羧化聚苯胺纳米纤维上，测试结果表明减少AHL自诱导物的产生，生物膜形成量比对照条件下减少了5倍。一些天然提取物已被证实可以抑制信号分子，如呋喃衍生物，可以通过抑制细菌群体感应，从而影响了生物膜的结构并加速了细菌分离的过程。Maslakci等[61]制备了经呋喃衍生物化学修饰的壳聚糖纳米纤维，结果表明其对PA生物膜的抑制率为91%。

近年来，基于一氧化氮(NO)的疗法是杀死细菌、去除生物膜和促进伤口愈合的一种有效的治疗方法。NO是一种非耐药性抗菌剂，会通过对DNA、脂质和酶的氧化应激来破坏细胞膜并杀死细菌[62]。此外，已有证据表明，NO还可以通过抑制信号分子环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)来消除生物膜。c-di-GMP是一种广泛存在于细菌中的新型第二信使，高浓度的细胞内c-di-GMP促进细菌从浮游生长模式到生物膜形成的转变，而NO通过直接或间接刺激几种磷酸二酯酶来降低PA的细胞内c-di-GMP水平，因而诱导细菌生长模式从聚集状态转变为浮游状态，最终导致生物膜破裂[63-64]。Li等[65]制备了一种苯丙氨酸基聚酯脲(Phe-PEUs)纳米纤维，通过使用亚硝基谷胱甘肽(GSNO)对其改性赋予纤维膜释放NO的能力，测试结果表明其对S.aureus生物膜抑制率为(89.3 ± 3.2)%。但是由于NO对细菌的作用比较复杂，且其作用方式与效果会由于细菌种类的不同而有所差异，因此在使用过程中要控制好NO的浓度等指标，从而发挥出有益的功效。

3 总结与展望

抗生素在临床细菌生物膜感染治疗方面发挥着不可替代的作用，但其引发的细菌耐药性问题也日益严重。生物膜结构以及生理作用的复杂性使单一抗菌剂难以有效将其消除，而静电纺丝技术生产的纳米纤维具有比表面积大、形态设计灵活等特点，作为能集成多种抗菌剂或治疗方法的平台在生物膜治疗领域显现出突出的优势，将其制成植入物涂层以及伤口敷料，在医疗卫生领域已初步崭露头角。尽管如此，基于纳米纤维的细菌生物膜感染治疗研究仍方兴未艾，在以下方面仍然可以有所作为：

a)目前的大多数研究都只针对一种细菌的生物膜感染模型，但临床上的生物膜感染包含多种细菌，因此在后续的研究中可以建立生物膜感染的混合模型，以评价其治疗效果。

b)为了避免于常规高剂量抗生素使用造成的耐药现象，应尽可能将纳米纤维与其他方法集成，建立能针对复杂生物膜结构中多个组分的疗法，达到协同增效的目的。

c)理想的抗菌剂递送系统需要在特定的时间按照设计的药物释放曲线来释放抗菌剂，以达到高效治疗的目的。但纳米纤维作为载体还存在抗菌剂的爆发性释放和低释放的问题，需要在静电纺丝中合理调控纤维的孔隙率、直径等参数，或是改进纳米纤维的载药方式，如同轴、三轴载药等，或是设计外界刺激(pH、光照、温度等)响应型抗菌剂释放系统，以期在未来设计出能够在合理时间内控制抗菌剂释放的新型抗菌剂递送系统。

d)针对慢性伤口可以建立多功能敷料。例如将三维纳米纤维气凝胶这种结构与抗生物膜手段结合，在治疗细菌生物膜感染的同时吸收伤口渗出物，起到促进伤口愈合的功效；或是将细菌生物膜识别功能与抗生物膜手段整合到纳米纤维上，建立诊疗一体化的伤口敷料，拓宽应用场景。