儿童哮喘与百日咳关系机制的研究进展

闫金燕 李小敏 马香

支气管哮喘(哮喘)是一种常见、多发的慢性呼吸系统疾病[1]，部分患者唯一的临床表现为反复咳嗽[2]。研究表明，呼吸道病毒、肺炎支原体及肺炎衣原体感染与哮喘急性发作密切相关，而细菌感染与哮喘的关系尚未明确[3-4]。百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis，BP)是儿童呼吸道感染常见细菌，人群普遍易感，常表现为反复剧烈咳嗽[5]，容易与哮喘尤其是咳嗽变异性哮喘相混淆[6]。此外，BP是毛细支气管炎的常见病原菌之一，Chen 等[7]研究发现，在3个月以下毛细支气管炎患儿中，BP感染的发病率为39.7%。众所周知，婴儿期毛细支气管炎与随后发展为哮喘之间存在正相关关系[8]。有学者认为，年幼时罹患毛细支气管炎的患儿中，5%～50%在20岁之前出现反复喘息或哮喘[9]。近年来，百日咳发病率显著上升，即百日咳再现[10-11]，且百日咳的传播人群和易感人群也发生了从婴幼儿到青少年和成人的改变，导致越来越多的人群感染后症状不典型，仅仅表现为咳嗽，尤其是夜间咳嗽，与哮喘有非常相似的临床特征。因此，百日咳与哮喘的关系引起学术界关注，并做了相应的研究。德国由于政治原因在二战时期分裂，东德及西德采取了完全不同的百日咳接种策略[12]，于1990年两国统一，其后学者们发现哮喘的发病率与百日咳的发病率呈现高度一致[13-14]，从而首次基于大规模的人群队列提出哮喘与百日咳的相关性。美国数据也显示18岁以下儿童1980—2007年哮喘发病率和1976—2012年亚临床百日咳发病率存在明显一致的上升趋势[15]。国内外随后有多项临床研究发现哮喘患者中存在百日咳感染的证据，例如有研究发现急性哮喘发作患者的呼吸道病原中BP检出率为28.4%[16]；2017年孟庆红等[17]研究数据显示60例哮喘患儿中共发现6例患儿存在近期或现症百日咳感染，占>6岁哮喘患儿的12.2%。在一项长达37年的纵向研究中得出结论，百日咳与青春期前和青春期哮喘发病风险增加相关[18]。国外学者在1995—2005年间21个国家的29个中心进行了横断面研究，结果发现，百日咳和麻疹与哮喘的较高发病率相关[19]。为研究百日咳感染和变应性疾病之间的关系，Kendirli等[20]在1997年和2004年进行了两项横断面问卷调查，结果显示患有百日咳的儿童哮喘患病率也显著增加。然而这种临床现象并不能圆满解释两者之间的关系，两种疾病之间的病理机制也不明确。笔者就百日咳与哮喘之间的机制研究进行了综述，以期更好地阐释两者之间的关系，为下一步的基础研究提供思路。

一、从分子水平看百日咳与哮喘的关系

1.免疫方面：哮喘的发病与免疫关系密切，以辅助性T细胞2(T-helpertype 2，Th2)优势应答、Th1/Th2细胞失衡、Th17/Treg免疫失衡为特征[21]，其中由白细胞介素-4(Interleukin4，IL-4)、IL-5和IL-13介导的Th2炎症被认为是哮喘的中心分子机制[22]。百日咳毒素(Pertussistoxin，PT)是促进百日咳发病的重要因素[23]。国外学者通过小鼠动物实验研究表明，PT也能激活Th2细胞，使IL-4、IL-5、IL-13和免疫球蛋白的产生增加[24-25]。研究已知，IL-4和IL-13是过敏性炎症中的关键细胞因子，IL-4可通过诱导黏蛋白基因表达，导致气道内细胞的杯状黏液分泌过多，诱导气道炎症[26]。血清IL-4、γ-干扰素(IFN-γ)浓度检测可以作为儿童哮喘的辅助诊断手段[27]。研究发现，IL-13和IL-4 均可诱导平滑肌对哮喘主要收缩通路的高反应性，从而促进气道慢性炎症及气道重塑[28]。BP感染后可以通过激活Th2细胞，促使IL-4产生增加，导致Th1/Th2细胞失衡并促进气道重塑。

Th17/Treg免疫失衡是哮喘发作的另一重要免疫机制，IL-17是Th17细胞产生的重要炎症因子[29]。BP感染的人树突状细胞可产生细胞因子IL-23，进而促进Th17的产生，提示Th17细胞在百日咳免疫中起着重要的作用[30]。在国外学者利用狒狒建立百日咳感染模型的实验数据中显示，在感染之前，狒狒的鼻腔灌洗液中IL-17水平变化不大，然而，在感染后第5天和第7天，IL-17水平显著增强至感染前的7倍。同时还发现，在感染后第2～3天 IL-6水平增加了440倍，第5天增加了50倍[31]。樊德利等[32]通过探讨支气管哮喘发病中肺表面活性蛋白A(SP-A)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8结果变化的研究发现，哮喘患者急性发作期IL-6水平显著高于缓解期及健康对照人群，提示IL-6在支气管哮喘的急性发作中有重要的作用。有研究指出，小鼠的百日咳疫苗接种也诱导了Th17反应，并可能通过IL-17增强中性粒细胞的介导作用。此外，IL-17在鼻黏膜中对BP的自然和获得性免疫均起关键作用[33]。众所周知，以IFN-γ和IL-17 分泌为特征的细胞介导免疫应答在BP的免疫应答中发挥重要作用[34]，在气道中，IL-17主要诱导中性粒细胞气道炎症、黏液分泌过多、杯状细胞增生、肌成纤维细胞分化和气道平滑肌增殖，此外，IL-17 通过激活上皮细胞、成纤维细胞和气道平滑肌细胞来促进气道重塑[35-36]。综上所述，BP感染后IL-6和IL-17水平显著增加，可促进支气管哮喘的气道重塑及急性发作。

近50年来，免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)被认为是过敏性哮喘的重要因素[37]。Schuter等[38]对25例年龄范围为9个月至12岁2个月的儿童进行前瞻性研究发现，百日咳感染时研究组IgE浓度为(62±30) U/L，在日后随访中，血清IgE浓度明显增加到(137±51) U/L，明显高于年龄匹配的对照组，表明百日咳可诱导儿童IgE的上升。一项动物实验通过制备BP并提取其外膜蛋白(outermembraneproteins，OMP)，检测总IgE和卵白蛋白(ovalbumin，OVA)特异性IgE的量，结果发现OVA和BP联合免疫豚鼠的血清总IgE和OVA特异性IgE较单用OVA免疫明显增加，且OMP有明显的促豚鼠肥大细胞脱颗粒的作用，由此得出结论：BP有较强的IgE佐剂活性。另外，某些OMP组分具有促进肥大细胞脱颗粒、组胺释放及增加小鼠对组胺致死敏感性的作用，提示BP感染或疫苗接种与IgE介导的哮喘有密切关系[39]。然而，亦有文献表明，百日咳疫苗对变应性疾病没有影响，甚至有保护作用，其组织病理学检查显示全细胞百日咳疫苗免疫可降低气道病理的严重程度，并降低暴露于甲胆碱后的支气管高反应性[40]。Bernsen等[41]对接种全细胞百日咳疫苗对特应性疾病的风险进行了研究，结果提示接种疫苗的儿童患特应性疾病的风险降低。有学者通过小鼠呼吸道过敏模型研究发现，在接种全细胞百日咳疫苗的动物中，特异性IgE降低，同时鼻和肺部炎症、气道重塑和转化生长因子β水平均减轻[42]，由此说明接种百日咳疫苗可减轻哮喘的气道炎症和气道重塑。也有观点认为，接种全细胞百日咳疫苗对儿童过敏性疾病和特应性致敏的发展没有影响[43]。由此可见，百日咳疫苗接种对哮喘的影响还需要更多的研究探索。国外学者以小鼠为实验对象，研究了百日咳皮肤坏死毒素、菌毛血凝素、k-凝集素原、脂多糖和PT对鸡蛋白蛋白抗体IgE和IgG1产生的影响，发现PT是提高鸡蛋白蛋白抗体IgE和IgG1效价的最有效佐剂[44]。有学者利用纯化抗体激活的IgE刺激8例哮喘患者和8例非哮喘患者的原代人气道平滑肌细胞，评估细胞计数、检测总胶原沉淀及胶原蛋白沉淀等，最终得出结论，IgE通过增加气道平滑肌细胞增殖和促炎性胶原和纤连蛋白沉积而促进哮喘气道重塑[45]。也有研究表明，IgE可直接激活气道平滑肌细胞产生细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α)、趋化因子(CCL5、CCL11、CXCL8、CXCL10)和传统介质，并导致气道平滑肌细胞增殖和收缩，气道平滑肌细胞的激活导致其肥大和增生[46]，两者都参与气道重塑，与哮喘的严重程度密切相关。

2.信号传导：Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路是一条常见的信号途径，它参与多种组织细胞的增殖、分化、凋亡等生命过程。近年来研究表明，Wnt信号通路与支气管哮喘的发病相关。国外学者通过刮擦单层支气管上皮细胞(bronchialepithelialcells，BEC)建立了体外损伤和修复模型，研究中发现BEC划伤间隙的闭合需要细胞迁移和增殖，β-catenin 的过度表达促进划伤的闭合，同时还发现β-catenin的积累通过促进与细胞增殖相关的细胞周期蛋白D1的表达参与了划痕伤口的修复[47]。贾宵宵等[48]通过建立大鼠慢性哮喘模型，获取大鼠气道平滑肌细胞进行研究，结果发现Wnt/β-catenin信号通路与丝裂原活化蛋白激酶信号通路相互作用和调控气道平滑肌细胞的增殖与分化等途径，影响气道平滑肌细胞功能，参与哮喘气道重塑。由于PT参与了多种形式的Wnt信号转导，由此可推测百日咳感染后可能通过PT参与Wnt信号转导促进气道炎症及重塑的过程[49-50]。在感染BP小鼠模型中PT还可高度上调与气道病理表现相关的Pendrin蛋白基因表达，由IL-17介导，通过NF-kB、JAK信号通路调节Pendrin在气道上皮细胞的表达，Pendrin的过度表达与哮喘相关，可能负调节气道表面液体的厚度，加强炎症反应，与气道高反应性和中性粒细胞浸润均有关。此外，Pendrin还可促进气道黏液的产生、黏蛋白的分泌，从而促进了气道炎症病理改变过程[51-53]。

Toll样受体4(TLR4)是免疫系统识别病原微生物的主要受体，通过激活宿主先天免疫在宿主防御中发挥重要作用，在诱导对感染的先天免疫中起关键作用[54]。有研究表明，TLR4影响BP感染后的肺病理学和促炎细胞因子的产生，对BP感染的天然免疫起重要作用[55]。有观点认为，TLR4在哮喘的发生中起重要作用，据报道，激活TLR4的表达可以直接或间接影响调节性T细胞的功能，从而影响Th1/Th2平衡，促进哮喘的发生[56]。由此可以推测，百日咳感染后可能通过激活TLR4的表达对哮喘产生影响。G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptors，GPCR)是与G蛋白相连接的最大膜受体家族，能够被不同的配体激活，如激素、多肽等。GPCR与配体结合后能激活细胞内的G蛋白，通过不同的信号转导通路产生不同的生物学效应[57]。GPCR对气道平滑肌和气道炎症的影响在哮喘中发挥重要作用，其中在气道平滑肌细胞上表达的GPCR通过调节气道平滑肌收缩和舒张在维持气道张力中发挥核心作用[58]。同时，GPCR也被认为能够介导收缩的气道平滑肌细胞舒张[59]。然而，PT作为一种二磷酸腺苷核糖化蛋白毒素，可抑制哺乳动物细胞中GPCR亚群的信号传递[60]。因此，BP感染后，PT可通过抑制GPCR的信号传导作用而加剧气道平滑肌收缩，从而导致气道阻力增加，加重哮喘的症状。

二、从细胞水平看百日咳与哮喘的关系

支气管哮喘的气道慢性炎症主要是由多种细胞(嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞等)和细胞组分参与[22]。百日咳感染后，可通过PT诱导细胞骨架重组，增加内皮细胞通透性，丧失细胞连接的完整性，引发气道炎症[61]。Wilson等[62]在对15例年龄范围为1个月至3岁半儿童百日咳的鼻上皮活检标本中观察发现，14例存在上皮细胞异常，纤毛细胞数量减少，纤毛稀疏的细胞数量增加，死亡细胞数量增加，细胞从上皮表面挤出，导致一种基本没有纤毛的上皮。显微镜下观察到发育不良的纤毛细胞及上皮之间的紧密连接被打破，这些变化将导致黏液纤毛清除系统破坏，气道清除感染微生物能力降低，利于BP的增殖及黏液的积累，促进气道炎症的形成。为探索BP与人呼吸道黏膜的体外相互作用，Soane等[63]研究了BP菌株BP536与人鼻甲组织在5 d内的相互作用，该研究发现，BP黏附于黏膜多个部位，引起高分泌和上皮损伤。此外，研究发现，PT还可以促进中性粒细胞趋化因子上调，导致中性粒细胞招募加剧[23]，促进气道炎症。腺苷酸环化酶是BP分泌的另一种主要毒素，这种毒素在细菌定殖的早期阶段起着关键作用。腺苷酸环化酶可通过触发细胞内cAMP的大量增加诱导宿主细胞显著的细胞骨架结构重塑、功能改变及肺泡上皮细胞的机械性能改变，同时降低了肺泡上皮细胞的迁移和伤口愈合能力，导致和加重气道炎症[64]。百日咳感染后可通过上述多种途径及机制促进气道炎症的形成，而慢性气道炎症是哮喘性支气管重塑的主要原因[65]。Th17细胞在BP感染中起重要作用，且IL-17水平升高；有研究表明，Th17细胞作为炎症反应的有效诱导剂，是严重哮喘的决定因素，具有较高的抗炎特性，还可以增加IL-17A和IL-17F的水平，进而加重中性粒细胞炎症反应。此外，IL-17通过趋化因子生长因子(G-CSF、GM-CSF和TNF-α)促进气道嗜酸性粒细胞增多；IL-17通过NF-kB信号通路直接增加气道中的平滑肌细胞，促进其收缩[66]。以上作用及机制均可促进支气管哮喘气道重塑的发生。缓激肽(Bradykinin，Bk)是一种前炎症分子及其相关肽段，是血管张力、急性炎症、疼痛和癌症的关键调节剂。有学者通过小鼠模型的实验研究发现，PT可促进或诱导Bk合成，并增强气道对炎症肽的反应，此外，Bk还参与了导致百日咳引起的咳嗽的级联反应[67]。在哮喘中，Bk诱导急性气道炎症反应，包括血浆蛋白外渗和平滑肌收缩进而导致气道阻塞，并可以介导嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等炎症细胞的募集，参与气道炎症及气道重塑的发生。此外，Bk激活上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、神经元和间充质细胞(如成纤维细胞、肌成纤维细胞和平滑肌细胞)[68]，这些细胞与气道慢性炎症、反应性和气道重塑的发展密切相关。

三、从组织水平看百日咳与哮喘的关系

哮喘的气道重塑包括气道壁增厚和平滑肌肥大增生、上皮细胞肥大和上皮下纤维化。BP在长期生长过程中释放的气管细胞毒素(trachealcytotoxin,TCT)可特异性损伤纤毛上皮细胞，导致纤毛阻滞和这些细胞的挤压、起泡及坏死[69]，引起呼吸道组织学改变。BP重要的毒性因子——PT是由S1、S2、S3、S4和S5等5个亚单位组成，S1主要具有酶活性和识别PT生物学活性的功能，例如促淋巴细胞增多、激活胰岛素细胞、簇集CHO细胞生长和组胺致敏等[70-71]。而组胺在哮喘气道炎症及气道重塑中起介导作用[72]，即PT可通过S1的组胺致敏作用促进气道重塑。在对抗宿主免疫方面，有学者通过小鼠动物实验证实，PT不仅与宿主气道反应的加剧有关，还可抑制宿主减轻气道炎症，从而加重气道炎症反应和气道病理，延长其恢复时间[73]。为探索PT在呼吸道定植中的作用，Carbonetti等[74]通过小鼠鼻内感染模型进行实验，结果发现，PT可延迟中性粒细胞在感染部分的募集，并在百日咳感染期间抑制整体抗体反应，抑制中性粒细胞对趋化因子的迁移[75],抑制驻留气道巨噬细胞的抗菌活性[76]，促进BP感染气道，加重气道的病理损伤。研究发现，纯化的TCT与脂多糖协同作用，可破坏纤毛气道上皮细胞，并对中性粒细胞产生有害影响，加重气道炎症反应[77]。此外，BP感染还伴有气道黏膜上皮细胞增生和黏液化生[78]，该病理变化与哮喘的组织病理学改变相似。

与上述观点相反，国外学者Sundqwist等[79]和Kugelman等[80]通过调查研究均发现，婴儿期百日咳不会显著增加儿童哮喘的患病率。在机制方面，有学者认为，百日咳感染后可导致纤毛稳态失衡，破坏呼吸道中的纤毛细胞但不引起炎症，也可通过Toll受体9途径抑制气道高反应[25]，故不会增加哮喘患病率，甚至可以减轻哮喘症状。由此可见，两者之间关系尚需进一步的研究。

综上所述，BP感染所致免疫机制、信号传导、气道炎症及重塑等方面均与哮喘病理过程相似，目前研究提示两者之间具有相关性，但也有相反的观点。近期已经监测到全国范围内百日咳患者明显增加，鉴于百日咳与哮喘可能存在一定的关系，可能会有更多的患者出现长期、慢性咳嗽等表现，并可能会导致哮喘的发生，因此，加强百日咳与哮喘关系研究，尤其是机制研究尤为重要。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献闫金燕和李小敏：资料收集、分析与撰写；马香：对文章的知识性内容做批评性审阅、指导