环介导等温扩增法对无痰或痰涂阴肺结核的诊断价值

曾芳 朱小霞 龚蕊 刘传红 石德俊 赵玲 杨松

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，是全球传染病中的头号杀手。新型冠状病毒感染(COVID-19)的大流行扭转了全球多年来在抗击结核病方面取得的成效，持续对结核病防控产生破坏性影响。2020年全球新报告结核病患者数约为580万例，较2019年降幅达18%，登记报告数已倒退至2012年水平，且报告数远低于实际发病患者数[1]。而最新的《2022年全球结核病报告》指出：2020—2021年期间，结核病的发病率上升了3.6%[2]，扭转了过去20年内每年下降约2%的趋势，结核病防治面临新的挑战。

肺结核患者是重要的传染源，早期诊断并及时给予规范抗结核治疗，有助于患者及其家庭获益，对全球结核病防治工作有积极意义。我国“十三五”结核病防治规划的目标明确要求肺结核病原学阳性诊断率达到50%[3]，这一目标仅靠分枝杆菌痰涂片荧光染色显微镜检查(简称“涂片镜检”)和分枝杆菌普通培养传统方法难以实现。分子生物学核酸检测技术的引入，使肺结核的诊断较以往更加快捷、便利。常用的技术包括GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术。其中，Xpert因生物安全级别要求较高且价格较昂贵不利于在基层常规开展，而LAMP因操作简便、耗时少且生物安全级别要求低等诸多优势，可能更适合基层医院用于早期诊断，但对二者在无痰/涂阴肺结核患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的检测研究还不多，鉴于此，本研究通过对此类患者的BALF同时行涂片镜检、LAMP和Xpert检测，以评价LAMP对这类患者的早期诊断价值。

资料和方法

一、研究对象

采用前瞻性研究方法，纳入2021年4月至2022年4月重庆市巫山县人民医院收治且符合入组标准的232例无痰/痰涂片阴性的疑似肺结核患者为研究对象，所有患者均在支气管镜下刷片行抗酸杆菌荧光染色显微镜检查(简称“支气管涂片镜检”)，并取BALF行LAMP和Xpert检测结核分枝杆菌复合群DNA。分析3种方法对本组患者的检测效能。本研究通过医院伦理委员会批准[批准文号：2021年伦审第(01)号]，所有研究对象均签署支气管镜检查知情同意书和临床研究知情同意书。

纳入标准：同时满足以下3个条件者。(1)符合《WS 288—2017肺结核诊断》标准[4]和《肺结核活动性判断规范及临床应用专家共识》[5]诊断标准(不包含Xpert和LAMP检出结果)中的疑似或临床诊断患者；(2)痰抗酸杆菌涂片镜检为阴性或无痰；(3)签署知情同意书者。

排除标准：(1)有支气管镜检查禁忌证或无法配合支气管镜检查者；(2)抗酸杆菌痰涂片阳性者；(3)单纯结核性胸膜炎患者；(4)既往有抗结核治疗史者。

二、研究方法

1.支气管镜检查回收BALF：术前完善血常规、凝血功能及心电图检查，仔细询问疾病史，是否合并严重心脑血管疾病，是否服用抗凝药物等，并嘱术前禁食水4 h，所有纳入患者均进行胸部CT检查，并根据胸部CT影像学定位，在病变区域进行支气管镜检查。使用注射器吸取10～20 ml生理盐水后推入目标支气管内进行灌洗，并借助负压抽吸生理盐水，回收约4～6 ml BALF送LAMP和Xpert检测。

2.分枝杆菌荧光染色镜检：在做支气管镜检查的同时，经过纤维支气管镜下活检孔放入支气管毛刷，在病灶部位刷取脱落细胞，均匀涂制玻片4～6张送检，行荧光染色显微镜检查。操作步骤及涂片结果判读遵循《WS 288—2017肺结核诊断》[4]标准中附录B。

3.BALF的LAMP检测：取约60 μl BALF加入样本处理管，90 ℃加热5 min，经过吸附剂试管处理，添加抽取的30 μl溶液于反应管中，充分混匀后，将反应试管插入LAMP专用恒温荧光核酸扩增仪[产品型号：LF-160；生产企业：EIKEN CHEMICAL CO.,LTD；注册证号：国食药监械(进)字 2014 第3402968 号]，在67 ℃反应40 min后进行结果判定。当出现绿色荧光即可判定为阳性，未出现绿色荧光即判定为阴性。

4.BALF的Xpert检测：取1 ml BALF与标准液混合均匀，室温下静置约20 min，取2 ml处理后的样品置于Cartridge反应盒中，运用Xpert检测仪进行测定，记录其结果。所有分子信标探针检测阳性或1条或多条分子信标探针检测阴性均判定为阳性(即检测到结核分枝杆菌)，所有分子信标探针检测阴性且样本处理质控阳性即判定为阴性；根据是否检测到利福平耐药记为利福平耐药或利福平敏感。

三、统计学处理

采用XLSX工作表和SPSS 22.0软件进行数据的录入和统计分析。计数资料以“例(百分率，%)”描述，组间差异的比较采用配对χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。以最终临床诊断为参考标准，评价涂片镜检、LAMP和Xpert等检测方法的检测效能，包括敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断符合率、约登指数(指数越大说明真实性越大)等指标。

结 果

一、 患者一般情况

研究共纳入232例患者，以最终临床诊断将患者分为无痰/涂阴肺结核患者(139例)和非结核肺病患者(93例)。139例无痰/涂阴肺结核患者中，男性99例(71.2%)、女性40例(28.8%)，年龄范围为14～79岁，平均年龄为(44.9±18.4)岁；93例非结核肺病患者中，男性67例(72.0%)、女性26例(28.0%)，年龄范围为15～79岁，平均年龄为(50.9±14.3)岁，疾病诊断包括肺部感染44例、非活动性肺结核19例、矽肺伴感染12例、慢性阻塞性肺疾病12例、肺肿瘤3例，以及肺脓肿、肺非结核分枝杆菌病和肺血管炎各1例。

二、 三种检测方法在两组患者中的检测结果

LAMP、Xpert和涂片镜检对232例疑似肺结核患者的检测阳性率分别为43.53%(101例)、43.97%(102例)和8.19%(19例)。其中，LAMP和Xpert对139例肺结核患者BALF的检测结果显示：二者均阳性者94例，均阴性者32例；LAMP阳性而Xpert阴性者6例；LAMP阴性而Xpert阳性者7例。经配对χ2检验，两者差异无统计学意义，即两种方法检测一致性良好，具体见表1。

三、三种方法对无痰/涂阴肺结核的检测效能

以临床最终诊断为参考标准，3种方法对无痰/涂阴肺结核患者的检测效能见表2。其中，LAMP和Xpert的检测特异度均为98.92%、阳性预测值分别为99.01%和99.02%，均与涂片镜检结果(均为100.00%)一致；但LAMP检测的敏感度、阴性预测值、与诊断一致率和约登指数均与Xpert接近，且均远高于涂片镜检。

表1 LAMP与Xpert对139例无痰/涂阴肺结核患者的检测结果

表2 三种方法对无痰/涂阴肺结核的检测效能

讨 论

世界卫生组织将“与2015年相比，2030年结核病死亡例数减少90%，结核病发病率下降80%”作为“终止结核病策略”的具体目标。要实现如此宏大的目标，需要在研发新诊断技术、新药核心治疗方案及有效的疫苗方面取得重大突破，并全面推广应用。2017年发布的《WS 196—2017结核病分类》[6]和《WS 288—2017肺结核诊断》[4]修改了肺结核确诊患者的条件，即增加了分子生物学检查结果的应用价值，这是国内首次在行业标准中明确了核酸检测技术的临床应用标准。同时，《结核病病原学分子诊断专家共识》[7]也详细介绍了不同分子诊断技术的原理、各自优缺点，以及各种不同方法检测结果的解读。

《2022年全球结核病报告》[2]指出：快速检测技术的使用目前仍然非常有限，在2021年640万例新发结核病患者的诊断中，只有38%的患者使用了世界卫生组织推荐的快速分子检测，略高于2020年的33%和2019年的28%。为积极响应世界卫生组织“终止结核病策略”并努力提高快速分子检测方法使用率，建议在肺结核诊断工作中应大力推广各种快速分子检测手段，以达到早期诊断的目的。我国2021年有57%的患者通过结核病快速诊断，明显高于全球平均水平(38%)[2]，但这一结果是建立在我国结核病防治项目中免费行Xpert检测的背景下。作为全球结核病高负担国家之一，理应继续全方位加大结核病防治力度以取得更佳的防治效果。目前，国内基层结核病定点医疗机构所用的是多年前免费配置的Xpert检测仪，主要用于临床确诊患者的免费耐药筛查，但该试剂成本高、收费昂贵，用于自费诊断时患者接受度普遍低；同时，基层医疗机构自行添置新的分子诊断仪器的经济承受力明显不足，其他分子快速诊断技术的选择仍然非常有限，因此，加大结核病诊断设备的更新投入，在基层医疗机构大力推广包括LAMP在内的结核分枝杆菌核酸快速分子诊断技术对我国结核病防控效果具有积极意义。

Xpert是最早应用于结核病诊断的分子生物学检验方法，被我国推荐为快速耐药筛查的首选方法。虽然Xpert技术在检测结核分枝杆菌时具有较高的敏感度和特异度[8-9]，且生物安全级别要求较高，加之当前尚无国内自主产权的Xpert检测设备，使得较为昂贵的收费价格在区(县)级基层医疗机构中难以常规开展。LAMP是另一类的新型分子生物学检测技术[10]，是一种快速、可靠的结核分枝杆菌诊断方法[11]。由于其基因扩增过程中不需要检测温度梯度的循环，仅需在恒定温度下即可完成扩增，设备自动化程度高。尽管LAMP方法扩增原理复杂，但其操作简便、耗时少、敏感度高、特异度强，且价格低廉，更适用于各级医疗卫生机构对结核分枝杆菌的快速检测[12]。

已有研究表明，LAMP和Xpert对不同痰标本中的结核分枝杆菌均有较高检出率，LAMP在结核感染及涂阴肺结核中也有较高诊断效能[13]，联合涂片镜检法后的诊断效能更高，而检测BALF中结核分枝杆菌更能明显提高菌阴肺结核的诊断阳性率，具有较高的诊断价值[14-15]。Yu等[16]发现LAMP对多种临床标本的检验结果均得到肯定的实验效果。诚然，LAMP在测定结核分枝杆菌DNA时，无论活菌还是死菌均可检出[17-18]，且临床可能有内镜消毒不严、标本污染等因素[18]引起假阳性出现，使得临床需结合抗结核治疗史等综合判断结核病的活动性。正如本研究中非结核肺病组中的1例LAMP假阳性患者，经补充询问病史后发现入组前曾有抗结核治疗史，考虑其为“死菌”引起。既往研究中，LAMP检测成人肺结核BALF早期快速诊断的研究较少[19]，考虑到理想的呼吸道检测标本是提高实验室检验阳性结果的基础和保障，而BALF可同时进行常规涂片显微镜检查及各种不同方法的核酸检测[20]，是更为适宜的标本选择。本研究以BALF为研究材料，以无痰/痰涂片阴性肺结核成人患者为研究对象，结果发现，LAMP检测疑似无痰/痰涂片阴性肺结核患者BALF的阳性检出率为43.53%，与贾枫等[21]研究结果(43.57%)一致，说明LAMP检测无痰/痰涂阴肺结核患者BALF的结果与检测痰液标本的结果一致，可明显提高此类患者临床诊断准确率，为患者早期确诊、及时接受规律抗结核治疗抢占了先机，对提高治愈率、降低致残率、遏制家庭及密切接触范围内广泛传播、利于结核病综合防治等多方面均具有积极意义；但支气管镜刷检涂片镜检对本组患者的阳性检出率最低，对非结核肺病患者的阴性检出率为100.00%，说明涂片镜检敏感度差、漏诊率高，不适合单独用于临床诊断，但其特异度高，可用于结核病的排除。另外，笔者也观察到LAMP和Xpert检测无痰/涂阴肺结核BALF的敏感度均远高于涂片镜检，但二者检测特异度均为98.92%，阳性预测值也均较高，说明LAMP检测阳性即可确定诊断，但考虑到临床中存在一定的漏诊率，尽管误诊率极低，但当LAMP检测阴性时仍需要结合其他临床表现和相关辅助检查，以及经验性治疗后的反应等多方面综合判断。研究还显示，LAMP和Xpert检测的约登指数均超过0.7，说明均具有良好的诊断价值，提示临床可单独选择其中任一种作为诊断的检测方法。

本研究尚有以下值得改进之处：第一，支气管镜刷检涂片镜检的阳性率最低，考虑与刷片及留取肺泡灌洗液的标本不一致有关，是研究的缺陷之一，建议在以后可取BALF浓缩离心后进行涂片镜检以进一步提高阳性检出率。第二，本研究限于县级医院实验室条件，未能进一步进行结核分枝杆菌培养和鉴定，但多项研究表明，LAMP检测的阳性率明显高于细菌培养的阳性率，且更具耗时短的最大优势[22-24]，认为结核分枝杆菌以外的其他分枝杆菌的干扰可能微乎其微。

总之，本研究对无痰/涂阴肺结核患者的BALF为检测样本行LAMP和Xpert检测，结果显示二者均有较高的敏感度和特异度，可明显提高涂阴肺结核患者的早期分子生物学阳性诊断率，结合其快速、价廉、操作简便等优点，有利于早期诊断、及时抗结核治疗，可在基层结核病定点医疗机构广泛推广。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献曾芳：研究方案总设计、负责课题实施、撰写文稿；朱小霞：协助研究方案设计、参与临床研究、全面收集整理数据；龚蕊：英文摘要撰写及修改、统计学处理；刘传红：撰写及具体操作支气管镜检查及BALF留取；石德俊：撰写实验室检验相关内容；赵玲：全面参与临床研究及CRF表的填写和数据收集；杨松：指导研究方案设计和审阅文稿