体外诊断的利器：化学发光免疫技术

苏彦妮，吕弋，张立春

四川大学化学学院，成都 610064

2019年底以来，新冠疫情的持续蔓延彻底改变了人们原有的生活，世界格局、外交贸易、经济民生均受到了严重冲击。对新冠肺炎患者的快速确诊能够控制疫情的扩散，是战“疫”的重点，所利用的工具便是“体外诊断(In vitro diagnosis，IVD)”技术。“体外诊断”具体是通过对人体的血液、体液及组织等样本进行检测而获取临床诊断信息，从而帮助判断疾病或机体功能的产品和服务[1]。体外诊断在疾病的筛查、诊断和治后检测的过程中具有重要的作用，被喻为医生的“眼睛”。近年来，作为免疫诊断市场的主流技术之一的化学发光免疫分析法在我国临床上不断普及，其市场规模快速增长，促使一系列的体外检测企业的建立、成熟。化学发光免疫分析技术究竟有什么优势，它的原理以及未来的发展趋势是怎么样的呢？

1 体外诊断技术介绍

根据检测原理和方法，体外诊断可主要分为：生化诊断、分子诊断、微生物诊断和免疫诊断[2]。

分子诊断是以分子生物学方法为基础，对遗传物质的结构或表达水平进行检测的技术[2]。如核酸检测利用的就是分子诊断方法，将病毒的RNA序列通过逆转录酶反转录为DNA并进行扩增，利用特异性Taqman探针对扩增得到的DNA“打上标记”，与靶标序列杂交时会产生荧光信号并被记录下来进行判断(图1)[3]。临床上，分子诊断还被应用于肿瘤早筛，针对明确的肿瘤进行相关标志物或基因检测可对肿瘤情况、病因、治疗效果、预后等进行评估。

图1 RT-PCR检测原理(Taqman探针法) [3]

免疫诊断是我国体外诊断领域中规模最大、市场上产品最多、发展速度不断加快的领域之一。从荧光免疫分析(fluorescene immunoassay，FIA)[4]，放射免疫分析(radio immunoassay，RIA)[5]，免疫胶体金[6]，酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)[7]到化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)[8]，免疫诊断领域不断发展。化学发光免疫分析方法相较于其他的免疫诊断技术不必使用放射性元素来标记，同时具有更高的稳定性，与其他技术的结合也给化学发光免疫分析技术的发展带来新的契机。其在食品、环境等领域都有使用，但在临床上我国从20世纪90年代才得到应用，而在欧美等国家，化学发光免疫技术已经在临床项目中得到普及，自动化仪器的生产制造已进入成熟期。

微生物诊断是指利用病人的痰、尿、血液、穿刺液及创伤口等处的原液来扩大培养，最终确定微生物的种类和浓度，从而判断病人的致病机理的方法[9]。临床上最常见的微生物诊断就是尿常规检测和大便常规检测，可以判断出体内的炎症情况。

生化检测是指通过基于生物化学反应，对人体内的大分子如蛋白质、糖类、脂肪，小分子如无机元素等的体外诊断方法[2]。临床上可以通过生化诊断实现对肝功能、肾功能、血糖、血脂等的检查。

2 化学发光免疫分析的原理和分类

化学发光免疫分析结合了化学发光反应和免疫学的特点，通过将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，抗原或抗体与待测物质发生特异性结合，随后加入氧化剂、化学发光底物或是电压的激发，通过氧化剂氧化发光物质，酶催化发光底物或是发光物质在电压的激发下形成高能的激发态，由于激发态不稳定，再回到基态过程中会以光的形式释放出能量，同时由于待测物浓度与发光强度在一定条件下呈线性定量关系，因此借助仪器检测发光的强度就可以确定待测物的含量[10]。以测定人绒毛膜促性腺激素(HCG)为例(图2)，待测物HCG首先与酶标记的抗体以及发光标记物标记的抗体反应，形成双抗体夹心复合物，随后再加入与含有与发光标记物结合的磁珠，通过磁铁将复合物聚集，最后加入发光底物产生光信号进行定量[11]。

图2 人绒毛膜促性腺激素化学发光测定原理

根据标记物的不同，化学发光可大致分为：利用吖啶酯、鲁米诺等进行标记的直接化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)、利用如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等标记的酶促化学发光免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)和利用三联吡啶钌等标记的电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)。直接化学发光免疫分析发光过程十分快速，在几秒钟之内就可以完成，而酶在一般情况下稳定性较好，如辣根过氧化物酶处于室温下可以在几周内保持稳定，且具有较高的特异性，发光时间较直接化学发光法更长，可以持续几分钟到十几分钟，电化学发光法处于电解池介质中反应因而可以反复使用。利用不同类别的化学发光法就可以满足分析所需要的不同要求，如快速检测、稳定性好、灵敏度高以及可循环利用，相较于分子诊断、生化诊断和微生物诊断具有极大的灵活性。

3 化学发光免疫分析的应用

化学发光免疫分析法首次被提出到现在已发展了40余年，其检测的体系不断成熟，所能检测的标志物数量不断增长，主要集中在医学、食品卫生、环境检测领域。

3.1 疾病标志物检测

对肿瘤标志物的检测在肿瘤的早发现、早治疗和治后检测中都具有重要的作用。利用化学发光法可以实现对于肿瘤标志物如甲胎蛋白(AFP)[12]、癌胚抗原(CEA)[13]、糖类抗原(CA125、CA153、CA19-9)[14,15]、人附睾蛋白(HE4)[16]、磷状细胞癌相关抗原(SCC)[17]、神经元特异性烯醇化酶(NSE)[18]、高尔基体蛋白(GP73)[19]等的检测。若标志物在人体内的含量升高，可以初步判断是否患有肝癌、胃肠道癌症、卵巢癌、子宫癌等癌症或是患有相关癌症的倾向。同时，在术后对这些指标进行检测还可以判断恢复情况。如正常人血清中利用化学发光法检测到的CA153参考值上限为35 U∙mL−1[20]，若高于该值，那么就判断患者可能患有乳腺癌或是一些其他的恶性肿瘤，需要进一步的检测来明确诊断。而乳腺癌患者中若体内CA153的值相比前次诊断升高，那么就可能显示着病情的恶化，若无变化则意味着病情稳定。

除了应用于肿瘤标志物检测外，化学发光免疫分析法还被应用于各类疾病的筛查。如对各类激素及其代谢产物包括人绒毛膜促性激素(total hCG)[21]、甲状腺素(total T4)[22]、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(Mb)[23]、甲型肝炎病毒抗体IgM (抗-HAVIgM)[24]等相关的联合检测，可以判断关于甲状腺、肝脏、肾脏、心血管、血液等方面疾病的患病可能性。在产前筛查中，应用化学发光法对游离-β-人绒毛膜促性腺激素(free β-hCG)、抑制素A (INH A)和胎盘生长因子(PLGF)等进行检测，可以对胎儿是否患有唐氏综合症和神经管缺陷疾病进行初步判断[25]。通过对转铁蛋白(TRF)、铁蛋白(FER)、可溶性转铁蛋白受体(sTfR)、叶酸(FA)和维生素B12(VB12)等进行检测则可以进行贫血的诊断以及原因判断[26]。对皮质醇(Cortisol)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(GH)和胰岛素样生长因子结合蛋白-3 (IGFBP-3)等进行检测可以判断是否有皮质醇增多症、肾上腺功能不全和多囊卵巢综合征等[27]。常见的高血压五项、TORCH项目、EB病毒六项和乙肝病毒五项均是利用化学发光免疫分析法进行检测，其在临床上还具有广阔的应用空间。

结合不同的技术，针对各种标志物的化学发光分析方法也在不断的发展，如Huang等[28]利用CdTe量子点标记与磁性纳米颗粒结合的抗体，通过电化学发光免疫测定方法，实现了对于甲胎蛋白的高效检测，在1.0–200 ng∙mL−1内都具有线性，检测限为0.32 ng∙mL−1，同时还具有检测其他标志物的潜力。Chen等[29]设计了一种利用免疫传感器阵列的成像方法，实现了对于甲胎蛋白、糖类抗原和癌胚抗原的测定，并用于对于肝癌、乳腺癌和卵巢癌患者的筛查。市场上基于化学发光免疫方法所构建的试剂产品不断出现，如Wang等[30]利用直接化学发光免疫分析法开发了一款检测降钙素的新型试剂盒，具有高灵敏度。

3.2 食品和环境安全检测

农药的滥用、药物的随意丢弃、污染物的任意排放以及食物腐败等问题会对人类健康造成影响，因此实现对这些影响物质的检测可以在一定程度上加强人们对食品和环境安全的重视程度。目前，化学发光免疫分析法已经被应用在针对农产品中福美双农药[31]、甲基对硫磷和吡虫啉农药[32]残留的检测，对食品中沙门菌和李斯特菌的检测[33]，以及对人体内分泌有干扰的外源性雌二醇的检测[34]等。如Wang等[35]利用鲁米诺还原的金纳米粒子，开发了针对芬戊酸盐的免疫层析化学发光检测方法，具有分析效率高、成本低的特点。Liu等[36]设计了一种新型且灵敏的增强化学发光酶联免疫方法用于测定农业样品中的吡虫胺和噻虫啉，结果与高效液相色谱方法一致。Juachon等[37]利用直接化学发光方法的猝灭效应来检测甲胺磷残留，甲胺磷浓度与化学发光系统的光输出成反比，线性范围为100–10000 μg∙mL−1。Pang等[38]利用电化学化学发光免疫分析法监测蜂产品中四环素类和土霉素抗生素残留，检出限分别为4.0 ng∙mL−1和3.8 ng∙mL−1，灵敏度高于绝大多数方法。

4 化学发光免疫分析技术发展趋势

21世纪以来，各种新标记物和标记方法，和其他技术的联用以及各种自动化、微型化的仪器不断被开发出来，化学发光免疫分析也朝着高灵敏度、多组分联合检测和自动化检测方向发展[31]。

4.1 高灵敏度检测

实际样品的丰度低，在检测过程中也存在着信噪比低的问题，同时如果检测方法稳定性不好的话也会对结果造成影响。化学发光免疫测定中，使用新发光试剂、增强剂，构建新的发光体系以及优化反应时间、选择合适的缓冲液等方法，可以大大提高检测范围和检出限及稳定性[39,40]。得益于纳米技术的发展，各种纳米粒子及结构也被引入化学发光体系中，如金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子等，由于它们具有高比表面积及电子密度，对于化学发光体系有很强的催化作用[41]。作为最广泛使用的金属纳米粒子，金纳米粒子可以作为模拟酶以及酶或大分子的载体。如Li等[42]以辣根过氧化物酶功能化的金纳米颗粒作为抗体标记物，利用三明治标记法，实现对人免疫红蛋白的信号放大检测，比原来工作中没有利用金纳米颗粒的方法信号提高了7.4倍，基本原理如图3所示。He等[43]则利用鲁米诺官能化的银纳米粒子，结合主成分分析，实现对于五种有机磷酸盐和氨基甲酸酯农药的区分，准确率为95%。磁性纳米粒子则可以作为免疫反应的载体，通过磁场将免疫复合物与原始溶液分离，大大缩短了检测的时间，提高了检测的灵敏度[44,45]。随着纳米技术领域的不断发展，利用纳米材料辅助的化学发光技术未来仍然具有广阔的发展空间。

图3 用于人血红蛋白测定的三明治式化学发光免疫分析原理

在免疫反应中，抗体是免疫测定性能的关键组成部分。随着基因工程的发展，通过基因重组技术已经获得了多种抗体片段或多功能抗体。如Ouyang等[46]利用杂交瘤策略设计了一种新型双特异性单克隆抗体BsMcAb，实现对于甲基对硫磷和吡虫啉的同时检测，在1.0–500 ng∙mL−1有线性关系，检测限为0.33 ng∙mL−1。随着基因工程抗体研究的不断深入，相信会为化学发光免疫检测带来新的应用[47,48]。

4.2 多组分检测

相比于单个组分的分析，对多组分进行联合分析可以获得更多的信息，得出的结论也更加具有说服力。若对多组分中的每种组分都进行单个分析，存在着耗时长、试剂消耗多的问题。通过结合空间分辨技术与阵列检测器的同时分析方法则可以实现对于高通量样品的快速检测，而且试剂消耗少[49,50]。如Fu等[51]设计了一个双通道流通池，实现了对于CA153、CA125、CA199和CEA四种肿瘤标志物的检测，移动光栅就可以获得被光电倍增管收集到的不同通道的信号(图4)。微流控芯片是实现多组分分析的有利工具。通过材料基质上刻蚀或压模便可形成所需要的微通道来实现所需的功能[52]。Hu等[53]设计了一种微流控芯片用于检测睾丸激素和C反应蛋白，芯片的顶部为试剂储存区，中部为抗原抗体储存区，底部为硅树脂基板。不同的试剂预先装载在储存区并通过程序控制的阀门避免进入微通道，当样品引入后预加载到微流体装置的单个储层中，并在关闭状态下通过片上机械阀从微通道中隔离。将样品引入后，阀门开启，通过发光仪可实现自动化检测。

图4 空间分辨化学发光免疫分析系统[51]

毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HPLC)具有极强的分离能力，可应用在化学发光免疫分析方法的前处理阶段[39]。除此之外，层析技术也实现了与化学发光技术的耦合。免疫层析技术(图5)通过样品在基质上的流动可以实现复杂组分中不同组分的分离以及反应产物与未反应产物的分离，不需要在分析过程中沉淀或是洗涤复合物，具有操作简便、简单经济的特点[54]。如Gao等[55]设计了免疫层析试纸条，通过记录在硝酸纤维素膜的两个测试区捕获的探针的化学信号，实现对于莱克多巴胺和沙丁胺醇的检测，基本原理如图5所示。

图5 结合免疫层析法对莱克多巴胺和沙丁胺醇的酶促化学发光检测原理

4.3 自动化检测

传统免疫分析需要将免疫物质人工混合导致反应效率降低，会耗费较多的时间。流动注射分析(flow injection analysis，FIA)由于不需要人工来进行操作，能够自动化地进行分析，可以减少误差，缩短反应的时间，已经被利用在基于化学发光方法的免疫测定中[56]。通过加快反应动力学如利用容易控制的电场来加快免疫物质的传质速率或是采用电磁搅拌等常用的方法同样可以减少分析时间，并且由于这些方法容易构建，可以大大提升化学发光免疫分析的自动化水平[33,57]。随着技术的发展，结合各类辅助方法，具有各类不同功能的全自动免疫发光仪不断被开发出来并应用在临床检测中。然而，目前自动化的化学发光免疫分析仪仍然由国外公司占主导地位，以罗氏(Roche)、贝克曼(Beckman)等公司产品为主[58,59]，国产化学发光免疫分析仪距离替代进口产品还有很大的进步空间。随着化学发光免疫分析法在我国临床上的普及，市场规模仍在不断增长，几大主要头部企业如亚辉龙(YHLO)、迈克生物(maccura)等的化学发光诊断设备及试剂已在检测结果和检测速度等方面接近进口产品[60,61]。相信随着国家一系列自主创新政策的落实以及对技术创新研发的推动，国产自动化仪器与国外产品之间的差距会逐渐缩小。

5 结语

化学发光免疫分析法作为免疫诊断市场的主流技术之一，具有高特异性和灵敏度的特点，在临床和食品、环境领域得到了广泛的应用。通过结合各种新标记物和标记方法，以及和其他技术的联用，能够大大提高化学发光免疫分析的检测能力。化学发光分析仪器的微型化、自动化、集成化和便携化，可以扩大化学发光免疫分析法的应用范围，具有很大的发展前景。相信随着化学发光分析法在临床上应用的普及以及我国企业的加速发展，必将缩小与国际上的差距，会有更多具有独立自主知识产权的国产商品出现在市场中。