lncRNA NBAT1通过MAPK通路影响肝癌细胞增殖和转移的机制

潘剑辉 苏子剑 林春城 潘群雄

(1福建省立金山医院(福建省立医院南院)普外科，福建 福州 350001；2福建医科大学附属泉州市第一医院肝胆外科)

肝癌具有高侵袭性、易转移的特点，病死率高、预后差〔1〕。肝癌的发生和发展是一个多因素参与、多途径形成的复杂病理过程，涉及多基因与多通路。虽然目前对肝癌的诊断及治疗有了很大的成效，但是对其发生发展的病理机制仍认识不足，因此探索新的肝癌相关生物学标志物对于肝癌的早期诊断及治疗和预后至关重要〔2,3〕。研究表明，一些lncRNA在肝癌组织中表达失控，与肝癌的发生、发展、转移关系密切，有望成为肝癌新的预防、治疗和预后的指标〔4〕。神经母细胞瘤相关转录物(NBAT)1是新鉴定的功能性lncRNA，在多种癌症中起肿瘤抑制剂作用；如NBAT1在胃癌组织中下调表达，其低表达与肿瘤分期和淋巴结转移及预后不良有关；过表达NBAT1抑制了胃癌的增殖、迁移和侵袭〔5〕。NBAT1在神经胶质瘤组织中也低表达，NBAT1过表达通过miR21/Y性别决定基因(SOX)7轴抑制神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭〔6〕。NBAT1通过miR-21-5p/细胞因子转导信号抑制因子(SOCS)6轴抑制膀胱癌的恶性细胞表型〔7〕。然而NBAT1在肝癌中的作用及机制尚不清楚。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在细胞的生长发育过程中起重要作用，主要包括细胞外信号调节激酶(ERK)途径、c-Jun NH2-末端激酶(JNK)及p38MAPK途径，MAPK信号通路通过一系列酶的激活与失活调节细胞内反应，影响肿瘤的生长和转移；且研究发现MAPK通路与肝细胞癌的发生、发展有关〔8,9〕。研究报道〔10〕，LINC00601上调通过激活MAPK信号通路促进肝癌的发展〔10〕。LINC00844通过靶向锌结合A2-糖蛋白(AZGP)1抑制MAPK信号传导，从而抑制肝细胞癌的进展〔11〕。然而lncRNA NBAT1是否通过MAPK信号通路影响肝癌进展尚不清楚，本研究旨在探讨lncRNA NBAT1是否通过MAPK信号通路影响肝癌进展。

1 材料与方法

1.1材料 收集泉州市第一医院收治的43例肝癌患者癌组织及癌旁组织，手术切除的组织标本立即用液氮保存，所有患者知情且同意。

1.2主要试剂 肝癌细胞株MHCC97H购自美国ATCC；RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司；MAPK通路抑制剂SB203580购自北京百奥莱博科技有限公司；Trizol试剂购自南京森贝伽生物科技有限公司；荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sciencell公司；Transwell小室、基质胶购自美国Corning公司；蛋白提取试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司；p-ERK、p-p38和p-JNK抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.3细胞处理与分组 肝癌细胞株MHCC97H用RPMI1640培养基培养，将NBAT1过表达载体及阴性对照质粒转染至MHCC97H细胞中，记为pcDNA-NBAT1组、pcDNA组；将10 μmol/L MAPK通路抑制剂SB203580处理MHCC97H细胞，记为SB203580组，正常培养的细胞记为Con组。

1.4实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测lncRNA NBAT1的表达水平 各取5 g肝癌组织及癌旁组织，加入Trizol试剂提取其总RNA，同时用Trizol试剂提取细胞pcDNA组、pcDNA-NBAT1组细胞的总RNA，反转录成cDNA，按试剂盒说明进行PCR，反应条件为95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40个循环；相对表达量用2-△△Ct法计算。lncRNA NBAT1上游引物：5′-ATTTCTGCTCCTGGGTCTTAC-3′，下游：5′-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3′，下游：5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3′。

1.5MTT检测细胞增殖 细胞培养48 h，加入20 μl的MTT溶液，培养4 h后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡反应10 min，酶标仪检测450 nm处吸光度(OD)值。

1.6克隆形成实验检测细胞克隆形成数 取pcDNA组、pcDNA-NBAT1组、SB203580组、Con组对数生长期细胞，制成细胞悬液，接种于6孔板中，每组设3个复孔，培养2 w出现肉眼可见克隆时终止培养，然后用吉姆萨染色30 min，在低倍光学显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.7划痕实验检测细胞划痕愈合率 pcDNA组、pcDNA-NBAT1组、SB203580组、Con组细胞消化后接种在培养皿中培养，在盘底用记号笔划线做标记，过夜细胞铺满后用枪头垂直横线划痕，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗划下的细胞，换液后继续培养，在培养0 h和48 h后拍照观察，用Image-Pro Plus6.0软件计算划痕愈合率。

1.8Transwell检测侵袭细胞数 将pcDNA组、pcDNA-NBAT1组、SB203580组、Con组细胞在无血清的培养液中饥饿12 h，调整细胞浓度为5×105个/ml；

用基质胶包被Transwell小室底部膜的上室，取100 μl细胞悬液加入Transwell小室，培养24 h，取出Transwell小室，弃去培养液后用PBS洗2遍，甲醇固定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，PBS洗3遍，用显微镜随机选取5个视野观察计数细胞。

1.9Western印迹检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，定量后取50 μl蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5 %的牛血清蛋白封闭1 h，然后加入一抗4℃过夜，洗膜后再加入二抗室温培养1 h，洗膜后加入化学发光试剂显影，成像后用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度水平，计算蛋白表达水平。

1.10统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1lncRNA NBAT1在肝癌组织中表达 肝癌组织中lncRNA NBAT1表达水平(0.35±0.04)显著低于癌旁组织(1.00±0.09；t=43.277,P=0.000)。

2.2过表达lncRNA NBAT1对肝癌MHCC97H细胞增殖的影响 与pcDNA组比较，pcDNA-NBAT1组肝癌MHCC97H细胞中lncRNA NBAT1表达水平明显升高，肝癌细胞活性明显降低，肝癌细胞克隆形成数明显减少(P<0.05)，见图1、表1。

图1 过表达lncRNA NBAT1对肝癌MHCC97H细胞克隆形成的影响(结晶紫染色)

表1 过表达lncRNA NBAT1对肝癌MHCC97H细胞增殖及转移影响

2.3过表达lncRNA NBAT1对肝癌MHCC97H细胞转移的影响 与pcDNA组比较，pcDNA-NBAT1组肝癌MHCC97H细胞的划痕愈合率明显降低，侵袭肝癌细胞数明显减少(P<0.05)。见表1、图2。

图2 过表达lncRNA NBAT1对肝癌MHCC97H细胞迁移及侵袭(结晶紫染色，×200)的影响

2.4过表达lncRNA NBAT1对肝癌MHCC97H细胞MAPK通路的影响 与pcDNA组比较，pcDNA-NBAT1组肝癌MHCC97H细胞中p-ERK、p-p38和p-JNK蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，见图3、表2。

1～2:pcDNA组,pcDNA-NBAT1组

2.5MAPK通路抑制剂(SB203580)对肝癌MHCC97H细胞增殖和转移的影响 与Con组比较，SB203580组肝癌MHCC97H细胞中p-ERK、p-p38和p-JNK蛋白表达水平明显降低，肝癌细胞活性明显降低，肝癌细胞克隆形成数明显减少，细胞划痕愈合率明显降低，侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。见图4、图5、表3、图6。

表2 过表达lncRNA NBAT1对肝癌MHCC97H细胞MAPK通路的影响

图4 两组信号通路相关蛋白表达

图5 MAPK通路抑制剂对肝癌MHCC97H细胞克隆形成的影响(结晶紫染色)

表3 MAPK通路抑制剂对肝癌MHCC97H细胞MAPK信号通路及对细胞增殖、迁移的影响

图6 MAPK通路抑制剂对肝癌MHCC97H细胞迁移和侵袭(结晶紫染色，×200)的影响

3 讨 论

随着医学水平的进步，肿瘤治疗手段增加，靶向治疗正成为新的治疗手段，其在肝癌中已有所应用，但仍需开发新的分子靶点〔12，13〕。lncRNA作为一种非编码RNA，其影响多种肿瘤进展，可作为分子靶点及生物标志物〔14〕。研究报道胶质母细胞瘤组织中NBAT1的表达低于正常脑组织，与恶性程度呈负相关；NBAT1上调通过调节蛋白激酶(Akt)抑制T98和U87细胞增殖〔15〕。lncRNA NBAT1通过miR-346/糖原合成酶激酶(GSK)-3β轴抑制肾癌细胞增殖和迁移〔16〕。lncRNA NBAT-1过表达可抑制A549细胞增殖和细胞周期，促进A549细胞凋亡〔17〕。本研究结果显示，lncRNA NBAT1表达水平低于癌旁组织，过表达lncRNA NBAT1可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，NBAT1在肝癌中也起抑癌基因作用。

lncRNA可通过调节细胞间信号转导参与肝癌的生物学过程，如LINC00978通过激活MAPK/ERK途径来促进肝癌细胞增殖、细胞周期进程和存活〔18〕。沉默lncRNA同源框基因口簇反义核糖核酸(HOXD-AS)1可通过MEK/ERK途径抑制肝癌细胞的增殖，细胞周期进程，迁移和侵袭〔19〕。lncRNA锌指结构反义转录本(ZFAS)1通过microRNA-624/肝素结合细胞因子(MDK)/ERK/JNK/p38信号通路增强肝细胞癌的发展〔20〕。以上均表明lncRNA可通过调控MAPK通路影响肝癌进展。本研究表明抑制MAPK通路激活可抑制肝癌进展。有研究报道，NBAT-1可能通过靶向ERK1/2和Akt信号传导途径抑制卵巢癌的发生〔21〕。为研究NBAT1是否在肝癌中影响MAPK通路，本研究结果表明，过表达NBAT1抑制了MAPK通路。

综上，过表达lncRNA NBAT1可能通过抑制MAPK通路抑制肝癌增殖和转移。