清润一号方对慢传输型便秘大鼠的作用及机制

秦婷婷 车瑾 曹蔚 韩慧敏 刘扬 程慧妤 夏俊 徐洋

(武汉市第三医院肿瘤科，湖北 武汉 430060)

慢性传输型便秘(STC)定义为结肠蠕动和粪便频率降低，通常伴有腹胀，是一种常见的胃肠道疾病，其不仅严重影响生活质量，而且给患者造成了一定的经济负担〔1，2〕。近年来，STC患病率不断增加，但其发病机制仍不清楚，使其成为临床治疗的难题。目前，用于治疗STC的药物是泻药和催化药物，刺激性泻药的使用效果显著，但不良反应明显，并且容易形成药物依赖性〔3〕。中医药治疗具有安全性高，疗效显著的优势。贴敷疗法是中医药治疗的一种，是将中药磨成细粉或做成膏剂，贴敷于穴位或者患处的治疗方式。研究表明〔4，5〕，穴位贴敷疗法可使中药通过穴位皮肤吸收，刺激穴位调节脏腑气血，达到治疗作用。临床研究〔6〕发现，清润一号方敷贴可缓解STC患者的便秘情况，本研究通过建立STC大鼠模型，探讨清润一号方中药敷贴方剂对STC大鼠的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁SD成年雄大鼠15只，体重(200±10)g，动物来源于三峡大学，实验动物生产许可证：SCXK(鄂)2017-0012，使用许可证，：SYXK(鄂)2018-0104。室内温度18～27℃，湿度45%～65%，正常喂食水，适应性喂养1 w后开始造模。

1.2药物 清润一号方〔6〕：50 g大黄(批号：20181201)，20 g玄明(批号：20181201)，20 g茴香(批号：20181001)，10 g泽泻(批号：20190404)，10 g玄参(批号：20190301)，10 g黄芪(批号：20180401)均购自湖北天济中药饮片有限公司；60 g医用凡士林隔水加热溶解成液状，按1∶2的终比例依次加入中药精细粉，混匀成膏状，冷却后备用。准备相应大小穴位贴，大小为3 cm×4 cm，其中给药区直径约1.5 cm。取调制好的膏剂5 g，涂于穴位贴中，制成直径1.5 cm，厚约0.5 cm的药膏。

1.3试剂与仪器 主要试剂：大鼠血管活性肠肽(VIP)、神经降压素(NT)、胃动素(MTL)、P物质(SP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Bioswamp，中国)；TritonX-100(北京索莱宝科技有限公司，中国)；甲醛，二甲苯，无水乙醇，30% H2O2，粉末活性炭(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，中国)。主要仪器：酶标仪(Ladsystems，芬兰)，离心机(湖南平凡科技有限公司，中国)，显微镜(Leica公司，德国)；冷冻切片机(湖北徕克医疗仪器有限公司，中国)。

1.4STC大鼠模型的构建及鉴定 造模组均每日给予洛哌丁胺混悬液10 ml(2 mg/kg，分别于每日9∶00，17∶00给药，每次5 ml)灌胃，共7 d。大鼠摄食量明显减少，粪便排出数量及质量显著降低，即建模成功。

1.5实验分组及处理 将15只SD大鼠分为对照组、模型组和中药贴敷组各5只。模型组：每日给予洛哌丁胺混悬液10 ml(2 mg/kg，分别于每日9∶00，17∶00)灌胃，共7 d。中药贴敷组：造模成功后贴敷中药，给药前1 d给大鼠腹部脱毛，面积约为5 cm×5 cm，酒精棉球消毒后在腹壁贴穴位敷贴，每贴内约含生药5 g，每24 h更换1次，共3 d。造模成功后，自贴敷给药第1天起，每日记录粪便数量(粒)和质量(干重和湿重)。

1.6粪便数量及含水率检测 记录给药后所有大鼠的首次排便时间，收集大鼠粪便，记录排便数量，测定粪便干、湿重，计算粪便含水率(%)=粪便湿重-粪便干重/粪便湿重×100%。

1.7活性炭推进实验检测肠道传输功能 用活性炭10 g加蒸馏水100 ml制成10%炭末混悬液，所有大鼠用10 ml 10%活性炭混悬液灌胃，并于2 h后颈椎脱臼处死，立即剖腹摘除从幽门至直肠末端的全部肠道，进行指标观察及测算。将摘除的全部肠道置于托盘中，在松弛状态下测量肠道的全长及活性炭混悬液在肠道内推进的长度，并计算活性炭混悬液推进长度与肠道全长的百分比。炭末推进百分率(%)=炭末前端与幽门的距离/肠道全长×100%。

1.8Cajal间质细胞(ICC)形态学观察 将所有肠道置于冰冻切片机中，用OCT包埋剂包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色。每张切片染色阳性区域随机选择5个高倍镜视野(×200)观察，并选择结肠区域环肌层在400倍光学显微镜下数阳性细胞个数，以每个高倍镜视野下阳性细胞个数的平均值做统计学分析。

1.9ELISA检测血清VIP、NT、MTL和SP的含量 给药结束后，从大鼠腹腔抽取5 ml血液，37℃静置30 min，待血液凝结后，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，放置-80℃冰箱保存，采用ELISA分别检测VIP、NT、MTL和SP含量，严格按照说明书上操作。

1.10统计学处理 采用SPSS23.0软件进行t检验，使用Graph Pad Prism5软件进行数据作图。

2 结 果

2.1清润一号方对STC大鼠粪便数量及含水率的影响 与对照组比较，模型组在第5天起粪便数量和含水率明显减少(P<0.05)。提示便秘模型构建成功。与模型组相比，清润一号方组进行敷贴治疗第8天起，粪便含水率显著增加，第9天起粪便数量显著增加(P<0.05)。见表1、表2。

表1 各组粪便数量的变化粒)

表2 各组粪便含水率的变化

2.2清润一号方对STC大鼠结肠传输功能的影响 与对照组〔(97.37±0.60)%〕相比，模型组活性炭推进率〔(92.83±0.15)%〕显著降低(P<0.05)；与模型组相比，清润一号方组活性炭推进率〔(96.67±0.40)%〕显著升高(P<0.05)。

2.3清润一号方对STC大鼠结肠ICC的影响 大鼠结肠ICC形态观察和阳性细胞数量变化：每张切片在400倍显微镜下观察，并计算阳性细胞个数，各组免疫组化结果表明，模型组ICC阳性细胞数〔(2.56±1.81)个〕较对照组〔(13.67±2.00)个〕明显减少，清润一号方组〔(6.78±1.86)个〕较模型组阳性细胞数显著增加(均P<0.05)。见图1。

2.4清润一号方对STC大鼠VIP、NT、MTL和SP的影响 与对照组比较，其余两组血清中VIP、NT、MTL和SP含量均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，清润一号方组血清中VIP、NT、MTL和SP含量均显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 清润一号方对血清中VIP、NT、MTL和SP含量的影响

3 讨 论

便秘会严重降低患者的生活质量，并给患者及其家人带来经济负担〔7，8〕。人们已经注意到STC对患者健康的影响，但仍需要进一步的研究以了解其发病机制并找到有效的治疗方法〔9，10〕。有临床研究发现〔11，12〕，中药穴位敷贴对便秘有较好的改善作用。本研究结果显示，经清润一号方组处理后，大鼠症状较模型组得到明显缓解，主要表现为粪便数量及含水量增多，结肠运输功能有所提高。

消化道同心脏，具有自然起搏器〔13〕，其收缩活动可受起搏器的慢波控制〔14〕。叠加在慢波电位上的动作电位可引起消化道平滑肌的收缩。ICC位于胃肠道的神经末梢与平滑肌细胞之间，具有产生电慢波，参与胃肠兴奋传递，调控胃肠平滑肌运动的自主节律性功能。因此，ICC已被认为是胃肠运动的起搏器细胞，同时也被认为是神经传递的介质〔15〕。ICC的减少和功能障碍可能导致结肠中慢波活动的减少，并阻断肠神经系统与平滑肌细胞之间的信息传递，延迟起搏器细胞与平滑肌细胞之间的电兴奋性传递，并导致平滑肌收缩力降低，结肠运动障碍和粪便转运延迟〔16〕。有研究发现，与正常者相比，STC患者结肠中的ICC密度显著降低〔17，18〕。因此可通过使用药物改善ICC功能来治疗STC。本研究结果说明，清润一号方对大鼠便秘的改善作用可能与ICC的调控有关。

有研究表明，神经递质的改变与STC的发病机制有关〔19〕，且ICC作为神经递质的靶向细胞，对一些神经递质具有反应性〔15，20〕。神经递质包括兴奋性递质和抑制性递质，SP、MTL和NT具有促进胃肠运动的能力〔21，22〕，VIP主要参与调解肠平滑肌和血管平滑肌舒张，增强胃肠道黏膜的分泌作用〔20〕。本研究结果提示，清润一号方可能是通过调控大鼠神经递质水平达到促进肠道蠕动、缓解便秘的功效。

综上，清润一号方在治疗慢传输型便秘方面具有较好的效果，其作用机制可能与调控ICC-肠神经网络促进肠道蠕动有关。