基于TLR4/NF-κB信号通路探讨槲皮素对直肠癌模型大鼠炎症反应和应激反应的影响

马仕虎 余昌达 陈志冰 张开华

(九江市第一人民医院普外科，江西 九江 332000)

直肠癌(CRC)是胃肠道最常见的恶性肿瘤，也是世界上第三大癌症相关死亡原因〔1〕，统计数字表明，男性比女性更易患直肠癌〔2〕。尽管CRC可以在任何年龄发生，但这种疾病的发生与年龄密切相关，最常见于50岁以上的人〔3〕。其他与生活方式和饮食因素相关的危险因素包括大量食用红色或加工过的肉类、肥胖、低水平的体力活动和吸烟，据报道都是导致CRC发生和发展的因素〔4〕。此外，CRC通常伴随着预后不良，在高收入国家(如澳大利亚、加拿大、美国和一些欧洲国家)5年相对生存率低于65%，但在低收入国家仍然低于50%〔2〕。目前CRC的治疗方法已经取得一定效果，但是耐药及治疗后的转移仍是亟待解决的一大难题。因此探究合适的治疗药物对于CRC的研究意义重大。槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮)是广泛分布于各种水果和蔬菜中。槲皮素及其衍生物具有许多健康促进作用，包括肿瘤的治疗。Toll样受体(TLR)4和核因子(NF)-κB在包括CRC在内的肿瘤发生过程中扮演着重要的角色。研究表明，在溃疡性结肠炎发展成CRC的研究中发现，使TLR4/NF-κB信号通路失活，可以减轻脂多糖(LPS)处理的人结肠组织细胞的氧化应激和炎症反应，阻止CRC的发生〔5〕。本研究通过建立CRC大鼠模型，从TLR4/NF-κB通路着手，研究槲皮素介导TLR4/NF-κB信号通路对CRC模型大鼠炎症反应和应激反应的影响。

1 资料与方法

1.1实验材料 SW480(美国ATCC)保存在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，美国Invitrogen，美国)。雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购于济南金丰实验动物有限公司。二甲基肼(DMH)购于J&K化学技术公司；槲皮素注射液来自医院合作实验室；TLR4和NF-κB p65一抗，购于abcam公司；PrimeScript RT试剂盒购于宝日医生物科技公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于上海晶抗生物工程有限公司；PCR试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1动物模型构建和分组 选择雄性SD大鼠(体重160～170 g)60只，在受控条件下将其置于适当的笼子中使其适应环境，并饲喂市售固体食物，大鼠随意进食和饮水。分为4组：Model组、槲斗皮素-L(25 mg/kg)组、槲斗皮素-M(50 mg/kg)组和槲斗皮素-H(75 mg/kg)组，选择NC组作为正常对照。NC组和Model组腹腔注射二甲基亚砜(DMSO)0.2 ml，生理盐水1 ml，1次/d；槲皮素处理组按照对应浓度每天腹腔注射，生理盐水1 ml，1次/d。每周皮下注射DMH(30 mg/kg)，持续18 w，建立CRC模型。动物实验获得了医院动物实验伦理委员会的批准。

1.2.2ELISA测定 在麻醉状态下取血后颈椎脱臼处死，4℃离心分离血清，分离后的血清放置在-80℃保存，使用ELISA试剂盒检测血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平。

1.2.3苏木素-伊红(HE)染色 所有的肿瘤标本经甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，进行HE染色，按照试剂盒操作进行试验。HE染色光镜病理组织学检查并摄片，观察各组显色情况。在形态学图像分析系统，在100倍放大倍数下取不同组别，并随机采集图像，实验重复3次。

1.2.4qRT-PCR法 采用RNA提取试剂盒(10296010，Invitrogen公司，上海，中国)提取各组肿瘤组织或职场组织总RNA，鉴定RNA纯度和完整性后，然后使用PrimeScript RT试剂盒(RR014A，宝日医生物科技公司，北京，中国) 将RNA逆转录成cDNA，逆转录体系10 μl，设计TLR4、NF-κB p65和GAPDH引物，交由TaKaRa公司合成。按PCR试剂盒操作步骤进行qRT-PCR，采用2-△△Ct法检测各组基因的表达量并进行比较。

1.2.5Western印迹 采用总蛋白提取液RIPA试剂盒(R0010，北京索莱宝科技有限公司)提取同一患者的直肠癌组织和癌旁组织总蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)方法测定蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至NC膜上，5%牛血清蛋白(BSA)室温下封闭1 h。滴加稀释的一抗小鼠抗人单克隆抗体TLR4和NF-κB p65，GAPDH，36 kD为内参照。4℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次10 min，然后孵育辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体。TBST漂洗3次。使用凝胶成像分析系统分析，以样本的平均吸光度除以相应内参照的平均吸光度，即为样本蛋白的相对含量，然后将各样本蛋白的相对含量间做统计分析图。一抗和二抗都是购自Abcam公司，实验重复3次。

1.2.6流式细胞术 碘化丙啶(PI)单染法检测：分别取各组组织100 mg，放入预冷的培养皿中，用眼科剪剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，调整为1×106个/ml，取1 ml细胞1 500 r/min离心10 min，弃上清，每毫升细胞加2 ml PBS，再离心，弃上清后，加入预冷的70%乙醇固定细胞，4℃过夜。第二天用PBS洗涤细胞2次，取100 μl细胞悬液，加入50 μg含RNAase的PI染液，避光30 min后用100目的尼龙网过滤，流式细胞仪检测细胞周期。膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/PI双标染色：将处理好的细胞置于培养箱中培养48 h，收集细胞、洗涤、离心，将细胞重悬于200 μl结合缓冲液中，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300 μl结合缓冲液，用流式细胞仪以激发波长488 nm检测细胞凋亡情况。

1.3统计学分析 采用SPSS21.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1槲皮素抑制直肠癌大鼠肿瘤发生 NC组、Model组、Quercetin-L组、Quercetin-M组、Quercetin-H组分别有12、11、10、9、9只大鼠存活至实验结束。Model组、Quercetin-L组、Quercetin-M组、Quercetin-H组大鼠直肠肿瘤发生率分别为100%(11/11)，100%(10/10)，77.8%(7/9)，66.7%(6/9)。

2.2槲皮素抑制IL-1β、IL-6和TNF-α表达 Model组炎症因子IL-1β，IL-6，TNF-α表达较NC组显著升高(P<0.05)，与Model组相比，槲皮素各处理组炎症因子IL-1β，IL-6，TNF-α显著降低(P<0.05)。且随着槲皮素浓度增大，IL-1β，IL-6，TNF-α表达明显降低(均P<0.05)，见表1。

2.3槲皮素改善CRC组织病理结构 HE染色结果显示，NC组组织结构完整，肠腺排列规则，而Model组结肠组织上皮细胞不规则，出现畸形腺窝灶，结构被破坏，槲皮素-L组、槲皮素-M组、槲皮素-H组结肠组织病理结构稍微有所改善，并且随着槲皮素浓度的增大，病理结构依次改善，见图1。

2.4槲皮素抑制TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白表达 Model组TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白表达较NC组显著升高(P<0.05)，与Model组相比，槲皮素各处理组TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白明显降低(P<0.05)，且随着槲皮素浓度增大，TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白水平明显降低(P<0.05)，见表1、图2。

表1 各组CRC炎症因子IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达

图1 各组组织病理学变化(HE染色，×200)

2.5槲皮素促进CRC细胞凋亡 与NC组相比，Model组S期、G2/M期细胞明显增多，G0/G1期细胞明显减少，与Model组相比，槲皮素各处理组S期、G2/M期细胞明显减少，G0/G1期细胞明显增多(P<0.05)，且随着槲皮素浓度增大，G0/G1期细胞明显增多，S期、G2/M期细胞明显减少(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI 双标染色法检测结果显示，与NC组相比，Model组凋亡率明显减少(P<0.05)，与Model组相比，槲皮素各处理组凋亡率明显降低(P<0.05)，且随着槲皮素浓度增大(P<0.05)，各组细胞凋亡率明显降低增大，见表2、图3。

1～5：NC组，Model组，槲皮素-L组，槲皮素-M组，槲皮素-H组

表2 槲皮素促进CRC细胞凋亡

3 讨 论

CRC常伴有严重的肠道和身体免疫系统疾病。肿瘤介导的炎症反应是其重要的病理特征之一，也是治疗肿瘤中遇到的难题。Malcomson等〔6〕研究表明，细胞的炎症反应促进CRC的发生发展，通过改善炎症反应可以改善肿瘤的进程，Solmaz等〔7〕研究表明，miR-330诱导通过在转录后水平抑制碱性亮氨酸拉链转录因子(BACH)1表达来抑制CRC细胞的增殖，能够进一步调控炎症反应进程，说明炎症反应和肿瘤细胞之间存在着密切的调控关系在治疗方面，对于CRC患者，化学疗法是不可避免的治疗方法，但是会加剧免疫功能障碍。肠黏膜炎是接受联合化疗的癌症患者中最常见和最有害的副作用之一，目前尚无有效的预防和控制措施。所以从炎症反应进行突破，寻找更加有效，副作用更小的CRC治疗药物有重要的意义。

槲皮素在正常细胞中具有潜在的抗癌能力，而没有明显的细胞毒性〔8〕。越来越多的研究表明槲皮素可能对各种类型的癌症(如结肠癌)具有治疗作用。Qi等〔9〕研究表明，槲皮素和β-葡聚糖交替食用可以降低结肠癌小鼠的死亡率。 另一项研究表明，槲皮素负载的单甲氧基聚(乙二醇)e聚(ε-己内酯)纳米胶束在体外和体内均可表现出增强的抗肿瘤活性，这可能是CRC治疗的潜在候选药物〔10〕。在其他肿瘤中，槲皮素可以通过降低Notch 1的表达及下游信号蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化水平改善白血病细胞的〔11〕。槲皮素还可以靶向调控胰腺癌细胞中的癌干样细胞和上皮间质转化表型〔12〕。

TLR是位于细胞表面的活性分子，可以触发细胞质信号通路来激活核因子(如NF-κB，IRF)，从而导致细胞增殖，耐药性及免疫细胞募集到肿瘤部位〔13〕。TLR系统构成了一把双刃剑，需要在肿瘤疾病的治疗中进行专门研究，TLR4被公认为是促进许多癌细胞免疫逃逸的关键因子〔14〕。NF-κB在肿瘤调控中也发挥重要作用，Zhu等〔15〕研究表明，MyD88调节的LPS/NF-κB/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路影响LPS诱导的结直肠癌细胞的炎症和生物学行为。Li等〔16〕在CRC中的研究表明，抑制NF-κB P65移位进入细胞核能够大肠癌异种移植物的肺转移，Ezrin和NF-κB的异常激活与大肠癌转移和预后不良有关。