小檗胺对人肺癌细胞增殖和凋亡能力的影响及其机制

陶荔，严佳栋

苏州大学附属张家港医院药学部，江苏张家港 215600

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率和致死率均位居第一，对社会和经济造成巨大影响。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的类型。目前对肺癌的治疗主要包括传统化疗、放疗、靶向药物治疗，近年来免疫检查点抑制剂的应用取得了一定的疗效，但是仍然存在肿瘤耐药、易复发以及不良反应重的难题。因此，寻找有效、安全的治疗药物是临床迫切需要解决的问题。小檗胺是小檗科植物中提取的双苄基异喹啉类生物碱，盐酸小檗胺片可治疗各种原因引起的白细胞减少，还具有抗心律失常、抗心肌缺血、降低心率、抗血栓等作用［1］。近年研究表明，小檗胺对多种肿瘤具有抑制作用，能够通过内质网应激通路诱导胃癌AGS 细胞凋亡［2］；抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖、侵袭和转移［3］；在体外将细胞周期阻滞在S 期，从而抑制膀胱癌的增殖和转移［4］。目前关于小檗胺在肺癌中的研究较少，其具体作用机制尚不明确。2019 年10 月—2020 年6 月，我们通过观察小檗胺对人肺癌A549 细胞增殖及凋亡的影响，探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞株A549购买于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。小檗胺购于上海麦克林生化科技有限公司，纯度＞98%，加入DMSO 配制成终浓度为100 μmol/L的储存液。培养基RPMI-1640购于美国Corning公司；胎牛血清购于美国Gibco公司；青霉素—链霉素溶液购于生工生物工程（上海）有限公司；MTT 试剂盒、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；结晶紫染色液购于北京索莱宝科技有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 购于美国Cell Signaling 公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 二抗购于上海碧云天生物技术有限公司。多功能酶标仪购于美国Thermo 公司；流式细胞仪购于美国BD 公司；凝胶成像系统购于美国BIO-RAD公司。

1.2 细胞培养 取A549 细胞，加入含有10%胎牛血清、1%青霉素—链霉素的RPMI1640 培养基中，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每1～2 天更换培养液。当细胞融合达到80%～90%时，PBS 洗涤，加入含EDTA 的胰酶消化，然后加入10% RPMI1640培养基终止消化，反复吹打使得细胞形成单细胞悬液。将细胞进行传代培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 细胞增殖能力观察 采用MTT 法。取对数生长期细胞制成单细胞悬液，按1.0×105/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，置于培养箱中培养24 h。将细胞随机分为对照组和小檗胺组，小檗胺组分别加入10、20、40 μmol/L 小檗胺，对照组加入等体积培养基。分别于培养24、48、72 h 后，取细胞加入MTT 溶液，37 ℃孵育4 h，加入100 μL DMSO 振荡混匀。上酶标仪，在450 nm 波长处测定每孔的OD 值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=小檗胺处理组OD 值/对照组OD值×100%。

1.4 细胞克隆形成能力观察 采用平板克隆实验。取对数生长期细胞制成单细胞悬液，按1×103/孔接种于6 孔板中，每孔2 mL，置于培养箱中培养24 h。将细胞随机分为对照组和小檗胺组，小檗胺组分别加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，对照组加入等体积培养基。培养7 d后，弃培养基，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，加入结晶紫染色液染色10 min。灭菌水洗涤，室温晾干。用数码相机拍照，光学显微镜下观察含有50个以上细胞的克隆，计算克隆形成率。克隆形成率=细胞克隆数/接种细胞数×100%。

1.5 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。将对数生长期细胞制成单细胞悬液，按1.0×105/mL 接种于6孔板中，每孔2 mL，置于培养箱中培养24 h。将细胞随机分为对照组和小檗胺组，小檗胺组分别加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，对照组加入同等体积的培养基。培养48 h 后，收集各组细胞，PBS 洗涤，1 500 r/min 离心5 min，弃上清。加入195 μL Annexin V-FITC 结合液重悬，再加入5 μL Annexin VFITC，最后加入10 μL PI 染色液，室温孵育20 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 以及PI3K/AKT 信号通路蛋白检测 采用Western blotting 法。取对数生长期细胞制成单细胞悬液，按2.0×105/mL 接种于6 孔板，每孔2 mL，置于培养箱中培养24 h。将细胞随机分为对照组和小檗胺组，小檗胺组分别加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，对照组加入等体积培养基。培养48 h 后，收集各组细胞，PBS 洗涤，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解20 min，12 500 r/min 离心15 min，收集上清，BCA法对各组细胞总蛋白定量。每组取40 μg蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳后转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 抗体（Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 稀释比例为1∶1 000，GAPDH 稀释比例为1∶5 000），4 ℃孵育过夜。第2 天TBST 洗3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。TBST 洗3 次，将1∶1 混合的ECL 发光液均匀滴至PVDF 膜上，用BioRad 凝胶成像仪获取图像。用Image J 软件对灰度值进行分析，以目的蛋白与内参GAPDH 的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量，以p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K表示蛋白磷酸化水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。采用Shapiro-Wilk法对计量资料进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。重复测量资料采用重复测量方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间细胞增殖情况比较 小檗胺组经10、20、40 μmol/L 小檗胺处理24、48、72 h 的细胞存活率均较对照组降低，40 μmol/L 小檗胺处理48、72 h的细胞存活率较24 h降低，20 μmol/L小檗胺处理72 h 的细胞存活率较24、48 h 降低（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组不同时间点细胞存活率比较（%，± s）

表1 两组不同时间点细胞存活率比较（%，± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与24 h 比较，#P＜0.05；与48 h 比较，△P＜0.05。

组别小檗胺组 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L对照组细胞存活率24 h 86.91 ± 4.95*71.36 ± 2.66*64.68 ± 2.10*100.00 ± 1.76 48 h 89.29 ± 6.29*67.02 ± 2.29*53.05 ± 4.03*#100.00 ± 2.53 72 h 79.00 ± 3.22*56.54 ± 4.20*#△47.10 ± 1.57*#100.00 ± 3.19

2.2 各组细胞克隆形成情况比较 小檗胺组经10、20、40 μmol/L 小檗胺处理后的细胞克隆数和克隆形成率较对照组降低，其中20 μmol/L 处理后较10 μmol/L 降低，40 μmol/L 处理后较10、20 μmol/L降低（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞克隆数及克隆形成率比较（ ± s）

表2 各组细胞克隆数及克隆形成率比较（ ± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与10 μmol/L 小檗胺组比较，#P＜0.05；与20 μmol/L小檗胺组比较，△P＜0.05。

组别小檗胺组 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L对照组细胞克隆数（个）203 ± 12*136 ± 16*#85 ± 9*#△310 ± 15克隆形成率（%）65.65 ± 5.95*43.88 ± 3.09*#27.37 ± 1.87*#△100.00 ± 5.19

2.3 各组细胞凋亡率比较 小檗胺组经10、20、40 μmol/L小檗胺处理后的细胞凋亡率分别为11.01% ± 0.09%、29.32% ± 0.18%、39.52% ± 0.29%，对照组为5.48% ± 0.23%。10、20、40 μmol/L 小檗胺处理后细胞凋亡率较对照组增加，其中20 μmol/L 处理后较10 μmol/L 升高，40 μmol/L 处理后较10、20 μmol/L升高（P均＜0.05）。

2.4 各组细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 表达水平比较 与对照组相比，小檗胺组经10、20、40 μmol/L小檗胺处理后细胞Bax、Caspase-3表达水平升高，Bcl-2表达水平降低；其中高浓度小檗胺处理后的细胞Caspase-3表达水平较低浓度小檗胺升高，Bcl-2表达水平较低浓度小檗胺降低（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平比较 （% ± s）

表3 各组细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平比较 （% ± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与10 μmol/L 小檗胺组比较，#P＜0.05；与20 μmol/L小檗胺组比较，△P＜0.05。

组别小檗胺组 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L对照组Bax 117.50 ± 2.02*122.31 ± 3.94*147.64 ± 2.08*#△100.00 ± 2.01 Bcl-2 80.19 ± 5.58*42.84 ± 6.37*#22.80 ± 4.94*#△100.00 ± 3.91 Caspase-3 108.43 ± 2.39*130.50 ± 1.66*#156.80 ± 3.75*#△100.00 ± 2.95

2.5 各组细胞PI3K、AKT 蛋白磷酸化水平比较 与对照组相比，小檗胺组经10、20、40 μmol/L 小檗胺处理后细胞PI3K、AKT 磷酸化水平均降低；其中高浓度小檗胺处理后的细胞PI3K、AKT 磷酸化水平较低浓度小檗胺降低（P均＜0.05）。见表4。

表4 各组细胞PI3K、AKT蛋白磷酸化水平比较（ ± s）

表4 各组细胞PI3K、AKT蛋白磷酸化水平比较（ ± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与10 μmol/L 小檗胺组比较，#P＜0.05；与20 μmol/L小檗胺组比较，△P＜0.05。

组别小檗胺组 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L对照组p-AKT/AKT 0.602 ± 0.028*0.513 ± 0.024*#0.437 ± 0.053*#△1.000 ± 0.035 p-PI3K/PI3K 0.846 ± 0.052*0.638 ± 0.038*#0.541 ± 0.070*#△1.000 ± 0.043

3 讨论

近年来，随着靶向药物和免疫治疗的发展，肺癌的治疗取得了一定进展，但肺癌仍然是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤［5］。很多肺癌患者在发现时已经是晚期或者有转移，失去手术机会。传统化疗药物不良反应大，容易耐药，而靶向药物和免疫治疗药物也存在耐药和复发的问题。中医药因高效、毒性小的特点而被广泛研究，一些中药制剂已经应用到临床实践［6］。小檗胺是从药用植物小檗科中提取的天然小分子化合物，可用于治疗白细胞减少症，对心血管疾病也有一定作用［7］。近年研究表明，小檗胺对多种肿瘤具有抑制作用。MENG 等［8］研究发现，小檗胺可以通过Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ有效抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。WANG 等［9］报道，小檗胺可通过调控AKT 和NF-κB 信号通路，抑制高转移性乳腺癌细胞的侵袭、迁移和增殖能力。金颖等［10］报道，小檗胺可以抑制胰腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡。本研究观察了不同浓度小檗胺对肺癌A549 细胞增殖和凋亡的作用，结果表明，小檗胺能够显著抑制细胞存活率，减少细胞克隆数和克隆形成率，促进细胞凋亡。这表明小檗胺对人肺癌A549 细胞有增殖抑制和促凋亡的作用。

细胞凋亡是一种程序性死亡，在抑制肿瘤的发生和发展中起着重要的调控作用。诱导细胞凋亡主要有2 种途径，一种是由细胞间信号激活的内在途径，即线粒体途径；一种是由细胞外信号激活的外在途径，即死亡受体途径［11］。Bcl-2 以及Bcl-2 家族成员Bax 是细胞凋亡中作用于线粒体的关键调控分子，Bcl-2 可以保护细胞膜通透性，抑制细胞凋亡，而Bax 作用与Bcl-2 作用相反，通过调节细胞线粒体膜的通透性，促进细胞色素C 的释放，激活Caspase 级联反应，导致细胞凋亡［12］。Caspase 家族蛋白被活化进而发生凋亡蛋白酶的级联反应是细胞凋亡的重要过程，Caspase-3 是其家族重要成员之一，是Caspase 级联反应下游的关键凋亡执行者，Caspase-3 的激活依赖于细胞色素C 的释放，最终促进细胞凋亡［13］。本研究结果显示，小檗胺处理组Bax 和Caspase-3 的蛋白表达量高于对照组，Bcl-2的蛋白表达量低于对照组，以上结果提示小檗胺可能是通过调控Bcl-2、Bax 以及Caspase-3 的表达从而促进肺癌细胞凋亡。

PI3K/AKT 信号通路是参与细胞代谢、增殖以及凋亡中的重要信号通路之一，在多种疾病如肿瘤、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病中发挥重要作用［14-17］。PI3K 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，当受到酪氨酸激酶或G 蛋白偶联受体的激活后，将底物PIP2 转化为PIP3。AKT 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K 信号通路中的一个重要下游靶点，PIP3 作为第二信使，与AKT 的N 端PH 结构域结合，使AKT 从胞质转移到细胞膜上，最终导致AKT 磷酸化而活化，进一步激活下游信号通路，调控细胞增殖、凋亡等过程［18］。谷田露等［19］报道，金雀异黄酮通过调控PI3K/AKT 信号通路抑制肺癌细胞增殖和侵袭转移。孟东雪等［20］报道，扶正抑瘤汤可以通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制非小细胞肺癌增殖、凋亡及自噬。本研究结果显示，小檗胺组PI3K、AKT 蛋白磷酸化水平低于对照组，表明小檗胺可能是通过PI3K/AKT 信号通路诱导细胞凋亡。

综上所述，小檗胺可以抑制人肺癌A549细胞的增殖、降低细胞克隆数和克隆形成率、诱导细胞凋亡，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT 信号通路有关。本研究为发现新的肺癌治疗药物提供了理论依据。