抑制内质网应激关键信号通路蛋白eIF2α去磷酸化与肝细胞增殖及c-Met表达的关系

陈欢，蒋小铃，李吉贵，方家琴，冯素敏，何毅怀，陈娅

1 遵义市第五人民医院内科，遵义 563000；2 遵义医科大学附属医院感染科

肝损伤进展为肝衰竭与肝细胞抗损伤能力低下、肝细胞再生能力等因素相关，因此增强肝细胞抗损伤能力、促进肝细胞增殖是治疗肝损伤的基本策略。促肝细胞生长因子（HGF）受体（c-Met）是受体酪氨酸激酶亚家族成员，对细胞生长转化、细胞周期、细胞抗损伤能力及增殖具有重要作用［1］。研究发现，c-Met 在急性肝衰竭中能够促进代偿性肝再生，是肝病治疗的潜在靶点［2］。内质网应激（ERS）是细胞的防御机制之一，对细胞增殖存在广泛影响。我们的前期研究发现，ERS 可下调c-Met 表达，影响肝细胞增殖，与肝病的发生发展密切相关［3］。ERS 作用于蛋白激酶R 内质网激酶（PERK）/真核细胞起始因子2α（eIF2α）、肌醇激酶1（IRE1）/X 盒结合蛋白1（XBP1）、活化转录因子6（ATF6）三条信号通路，通过减少新生蛋白的合成、激活内质网相关降解（ERAD）减轻内质网压力，恢复内质网稳态［4］。ERS 与肝损伤的发生发展密切相关，但ERS 影响肝细胞增殖的具体分子机制尚不明确。2018年1月—2020年1月，我们通过构建ERS肝细胞模型，探讨抑制eIF2α 去磷酸化影响肝细胞增殖及c-Met 表达的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 正常人肝细胞株L02购自中国科学院。内质网钙平衡抑制剂毒胡萝卜素（TG）、eIF2α 去磷酸化抑制剂Salubrinal 均为Sigma-Aldrich 公司产品；胎牛血清（Gibco），RPMI1640 培养基（Hyclone），青—链霉素混合物、0.25%胰酶（索莱宝），DMSO 试剂（Amresco），eIF2α、c-Met单克隆抗体（Santa Cruz），peIF2α、XBP1 单 克隆 抗 体（Cell Signaling），HRD1（SAB4200423，Sigma），GAPDH 多 克 隆 抗 体（ET1601-4）。蛋白质电泳仪（Bio-Rad），ECL 化学发光成像仪（ChemiScope 6000，Clinx），全波长酶标仪（Biotek）。

1.2 细胞培养 取L02细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。至细胞生长密度≥85%时进行传代培养。

1.3 肝细胞ERS模型的构建

1.3.1 细胞分组与干预方法 取1 mg TG 溶于1.537 mL DMSO 中，配制成含1 mg/mL TG 母液，使用前加入含10%胎牛血清培养基稀释为1 μmol/L的TG 溶液。取对数生长期细胞，随机分为TG 组和对照组，TG 组加入含1 μmol/L TG 的RPMI1640 培养基，对照组仅加入RPMI1640培养基，培养48 h。

1.3.2 TG 对细胞增殖能力的影响观察 采用CCK-8 法。于培养0、48 h，取两组细胞，加入10 μL CCK-8 试剂孵育60 min，置酶标仪450 nm 处测定吸光度（A）值。

1.3.3 TG 对细胞ESR 相关蛋白p-eIF2α、ERAD 通路相关蛋白HRD1 以及c-Met 蛋白表达的影响 采用Western blotting 法。细胞培养0、48 h 时，使用蛋白提取试剂盒按照说明书步骤提取蛋白，用BCA 法检测蛋白浓度。通过电泳分离肝细胞裂解物，转移到PVDF 膜上。用TBST 封闭膜，分别加入稀释的GAPDH、p-eIF2α、HRD1、c-Met 一抗4 ℃孵育过夜。TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠或抗兔IgG 二抗，室温孵育1 h。TBST 漂洗3 次，用ECL试剂盒曝光蛋白条带，获得蛋白条带灰度值。以目标蛋白与GAPDH 蛋白条带灰度值的比值计算目标蛋白的相对表达量。

1.4 Salubrinal 预处理对肝细胞ERS 及细胞增殖的影响观察

1.4.1 细胞分组与干预处理 取5 mg Salubrinal溶于208.4 μL DMSO 中，配制成含50 mmol/L Salubrinal的母液，使用前加入含10%胎牛血清培养基稀释为20 μmol/L。将细胞分为TG 组和Salubrinal+TG组。待细胞生长融合度为70%～80%时，Salubrinal+TG组加入20 μmol/L Salubrinal预处理2 h，然后加入1 μmol/L TG 培养48 h；TG 组加入1 μmol/L TG培养48 h。

1.4.2 细胞增殖能力观察 采用CCK-8 法检测两组细胞增殖能力，步骤参照“1.3.2”。

1.4.3 细胞p-eIF2α、XBP1、HRD1、c-Met 蛋白表达检测 采用Western blotting 法检测两组ESR 相关蛋白p-eIF2α、XBP1，ERAD 通路相关蛋白HRD1，以及c-Met蛋白表达，步骤参照“1.3.3”。

1.5 统计学方法 应用SPSS24.0 统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smironv法进行正态性检验，符合正态分布的资料以± s 表示，两组间比较采用独立样本T检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞ERS 模型构建结果 与对照组相比，TG 组p-eIF2α、HRD1表达水平升高，c-Met表达水平降低（P均＜0.05）。TG 组ERS 相关蛋白p-eIF2α 表达上调，ERAD 通路激活，表明ERS 细胞模型构建成功。TG 组和对照组细胞增殖A 值分别为2.23 ± 0.18、3.00 ± 0.13，TG 组细胞增殖活力低于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组细胞p-eIF2α、HRD1、c-Met蛋白表达水平 比较（ s）

表1 两组细胞p-eIF2α、HRD1、c-Met蛋白表达水平 比较（ s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；

组别TG组对照组p-eIF2α 15.65 ± 1.41*1.00 ± 0.08 HRD1 13.49 ± 1.26*1.00 ± 0.06 c-Met 0.19 ± 0.01*1.00 ± 0.09

2.2 Salubrinal 预处理对肝细胞ERS 及细胞增殖的影响 与TG 组相比，Salubrinal+TG 组细胞p-eIF2α、c-Met 蛋白表达水平升高，XBP1、HRD1 蛋白水平表达降低（P均＜0.05）。见表2。Salubrinal+TG 组和TG 组 细 胞 增 殖A 值 分 别 为2.64 ± 0.19、2.23 ± 0.17，Salubrinal+TG 组细胞增殖活力较TG 组升高（P＜0.05）。

表2 两组细胞p-eIF2α、XBP1、HRD1、c-Met蛋白表达 水平比较（± s）

表2 两组细胞p-eIF2α、XBP1、HRD1、c-Met蛋白表达 水平比较（± s）

注：与TG组比较，*P＜0.05。

组别Salubrinal+TG组TG组p-eIF2α 2.46 ± 0.16*1.00 ± 0.06 XBP1 0.54 ± 0.02*1.00 ± 0.07 HRD1 0.68 ± 0.03*1.00 ± 0.07 c-Met 1.77 ± 0.06 1.63 ± 0.09

3 讨论

肝脏在受到不同类型的损伤后具有较强的再生能力。肝脏再生的潜力在决定肝脏疾病的结局中至关重要，特别是患有肝功能失代偿、肝再生受损的肝纤维、急性肝衰竭的患者［5］。但是，在一些病理条件下，如慢性乙醇摄入、脂肪肝疾病、肝硬化、肝衰竭、胆道梗阻，肝再生是延迟或受损的，其具体机制尚不明确。有研究发现，在急性和慢性肝损伤中，HGF/c-Met 信号对肝细胞和肝祖细胞再生能力具有显著的促进作用［6］。ERS 是众多肝脏疾病的常见现象，对肝细胞的增殖与分化存在广泛影响。内质网是细胞内合成蛋白质、肽链折叠、修饰及脂类、糖类合成的重要场所，内质网还通过对钙的贮存与释放参与细胞内钙离子浓度的调节。当细胞受到缺氧、钙平稳紊乱等刺激引起内质网稳态失衡，使内质网腔内未折叠蛋白、错误折叠蛋白聚集，钙离子浓度改变时，可诱导ERS 发生。ERS 包括未折叠或错误折叠在内质网蓄积引起的未折叠蛋白反应（UPR）、正确折叠的蛋白在内质网过度蓄积、激活NF-κB 引发的内质网超负荷反应、胆固醇缺乏引发的胆固醇调节级联反应。ERS 诱导剂TG 能够不可逆地阻滞钙ATP 酶，阻止钙从细胞质向内质网重吸收，导致ER中钙浓度降低，抑制钙依赖性分子伴侣，使错误折叠的蛋白质增加，从而诱导ERS［7-8］。本研究采用TG诱导L02 细胞建立ERS 细胞模型，探讨ERS 与肝再生之间的潜在关系。结果表明，1 μmol/L TG 可显著增加肝细胞ERS 相关蛋白p-eIF2α 磷酸化水平，ERAD 通路激活，表明ERS 细胞模型构建成功；肝细胞增殖活力和c-Met 蛋白表达均下降，提示ERS 可下调c-Met蛋白表达，抑制肝细胞的增殖。

目前一般用UPR 来提示ERS 的发生。UPR 有3个应激感受蛋白，即PERK、ATF6、IRE1α，通过这些蛋白发挥作用，增强内质网对蛋白的折叠能力、促进内质网腔的错误折叠蛋白降解、减少蛋白质合成，从而恢复内质网的稳态。eIF2α 是调节ERS 的关键信号通路蛋白之一。细胞ERS 可激活未折叠蛋白反应，激活PERK 转化为具有活性的p-PERK，进而磷酸化eIF2α 生成p-eIF2α，p-eIF2α 可抑制eIF2B 催化eIF2·GDP 到eIF2·GTP 交换的功能，使得eIF2 不能被重复利用，降低AUG 启动密码子识别率，从而抑制大多数蛋白质合成的启动过程，抑制细胞整体的蛋白翻译水平，从而减轻内质网负担，维持内质网平衡的稳态［9］。p-eIF2α 也可经蛋白磷酸酶1（PP1）作用恢复至eIF2α 非活性状态。Salubrinal 作为eIF2α去磷酸化抑制剂，通过抑制PP1 活性来抑制p-eIF2α去磷酸化（即保持其磷酸化状态），减少蛋白合成，从而起到缓解细胞ERS 的作用［10-12］。为了观察eIF2α对肝细胞中c-Met 表达的影响及机制，本研究用Salubrinal 预处理抑制TG 诱导的ERS 细胞模型eIF2α去磷酸化，结果显示经过Salubrinal 预处理后，eIF2α磷酸化水平较TG 组显著增加，ERS 标志蛋白XBP1显著下降，提示Salubrinal 可以缓解细胞ERS。这与TIAN 等［13］的研究结果相符，即Salubrinal 抑制eIF2α去磷酸化可以减轻细胞ERS。为明确Salubrinal 减轻ERS 后对细胞增殖的影响，随后检测了c-Met 蛋白表达和细胞增殖活力，结果显示经过Salubrinal预处理后，与TG 组相比，c-Met 的下调趋势可部分逆转，肝细胞增殖活力部分回升。CHEN 等［11］也得出了类似结果，L02 细胞经Salubrinal 减轻ERS 后，反映再生的标志蛋白Cyclin D1 也得到了部分回升。以上研究表明，Salubrinal 具有抑制蛋白的翻译作用，但促进再生的指标c-Met 却部分恢复，提示eIF2α 磷酸化对蛋白质翻译的抑制作用并不直接调控c-Met蛋白的表达。

ERAD 是ERS 的反应形式之一，其降解机制是IRE1/XBP1/EDEM 信号通路对蛋白质发挥质量控制的关键机制，它可以直接作用于错误折叠或组装不完全的前体蛋白，使其逆向转运进入细胞质并被蛋白酶体降解［14］。HRD1 通过其生物活性域E3 泛素连接酶参与ERAD，促进蛋白质逆转易位［15］。本研究结果显示，ERS 能够上调HRD1，激活ERAD 信号通路；给予Salubrinal 预处理后，XBP1、HRD1 蛋白表达水平较TG 组降低，提示ERAD 及ERS 减弱。c-Met在给予Salubrinal预处理后表达的部分恢复是否与激活内质网相关降解的减弱有关，目前尚不明确，有待进一步研究。

综上所述，在肝细胞ERS 模型中，抑制eIF2α 去磷酸化可部分恢复肝细胞c-Met 表达，促进细胞存活，其机制可能与反馈减轻ERS 有关。抑制eIF2α去磷酸化有望成为恢复损伤肝细胞增殖的靶点。