干扰微小染色体维持基因表达对人胰腺癌细胞增殖和迁移的干预作用及其机制

杨才平，张强，韩婷婷，洪瑜，洪鲜，孙贺，邓志会

1 齐齐哈尔医学院医药科学研究院，黑龙江齐齐哈尔 161006；

2 齐齐哈尔医学院基础医学院

胰腺癌是一种侵略性极强的消化道恶性肿瘤，具有很强的增殖和迁移能力。由于胰腺癌的临床表现隐匿，缺乏敏感性高、特异性强的早期诊断方法，患者不能及时有效的采取治疗措施，5 年生存率低于5%［1］。深入探讨胰腺癌发生发展的生物学机制，对提高胰腺癌的早期诊断率及减少术后复发、转移具有重要意义。微小染色体维持（MCM）蛋白是AAA+ATP 酶蛋白超级家族成员，在真核生物中由MCM2～7 共6 个蛋白组成MCM 复合物，发挥DNA解旋酶作用。MCM 复合物是DNA 复制起点的装配物质，参与激活DNA 复制，并促进DNA 合成，在精确的DNA 复制调控中发挥关键性作用。MCM 蛋白之间可以相互结合，组成不同的亚型复合物，如MCM2/4/6/7、MCM4/6/7、MCM3/5 等，其中MCM4/6/7 复合物在体外具有ATP 酶和DNA 解螺旋酶活性［2］。结构生 物 学 研究显示，MCM 复合物按照MCM2-MCM6-MCM4-MCM7-MCM3-MCM5 的顺序以1∶1∶1∶1∶1∶1 的比例形成环状异六聚体。MCM2 和MCM5之间存在一个动态的“门”［3］，MCM2/5门关闭是激活DNA 解螺旋和延伸所必需的，同时MCM2/5门构象变化将DNA 复制限制在S 期，确保每个DNA片段在一个细胞周期内只能复制一次［4］。MCM 在有增殖活性的细胞内表达，其表达异常与肿瘤发生有关，在肝癌［5］、肺癌［6］、胃癌［7］和乳腺癌［8］等多种恶性肿瘤中均发现MCM 蛋白高表达。研究显示，MCM2～7 通过调节细胞周期蛋白表达参与细胞周期进展，影响肿瘤的发生［9］。但是关于MCM 复合物在胰腺癌中的生物学功能研究较少。基于MCM2参与形成动态门以及MCM4/6/7 三聚体具有DNA 解螺旋酶活性，2020 年8 月—2022 年8 月，本研究以MCM2、MCM6 为目标蛋白，通过RNA 干扰技术分别建立MCM2 和MCM6 基因沉默的稳定细胞系，观察MCM 复合物对胰腺癌PANC-1细胞增殖和迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人胰腺癌PANC-1 和人胚胎肾HEK293T 细胞购自国家实验细胞资源共享服务平台。DMEM 和链霉素青霉素购自Gibco；胎牛血清购自Clark Bioscience 和康源生物；转染试剂聚乙烯 亚 胺（PEI）购 自Polysciences；CCK-8 试 剂购 自Med Chem Express；Transwell 小 室 购 自Corning Incorporated；总RNA 提取、质粒小提、质粒大提和Bradford 蛋白定量试剂盒购自天根生化科技有限公司；蛋白酶抑制剂购自Roche；DNA 连接酶购自New England Biolabs；聚凝胺（Polybrene）购自北京富百科生物技术有限公司，抗GAPDH 鼠单克隆抗体购自Proteintech Group；抗MCM2兔多克隆抗体购自Bethyl Laboratories；抗MCM6 兔多克隆抗体购自Thermo Fisher scientific；HRP 标记的羊抗兔IgG 和羊抗小鼠IgG购自Santa Cruz。引物合成及质粒测序由上海生工生物工程有限公司完成，其他试剂均为国产分析纯化。实时荧光定量PCR 仪、二氧化碳恒温培养箱购自Thermo Fisher Scientific，PCR 仪购自Bio-Rad，酶标仪购自奥地利Tecan 有限公司，紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司，TGem微量分光光度计购自天根生化科技（北京）有限公司，蛋白垂直电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司，倒置显微镜购自尼康公司。

1.2 细胞培养 取PANC-1和HEK293T细胞，加入含10% FBS 的高糖DMEM 培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养。

1.3 shRNA 慢病毒溶液的制备 利用小干扰RNA（siRNA）在线设计软件（http：//sirna. wi. mit. edu/）设立对照shRNA 以及能识别MCM2、MCM6 序列的特异性shRNA 序列。对照shRNA 序列为5' -CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3'，特异性shMCM2序列为5'-CATCAGCGACATGTGCAAAGA-3' ，特 异 性sh MCM6 序列为5'-CAGACCATATCCATCACTAAA-3'。使用PEI 转染试剂，将带有目的shRNA 序列的质粒以及两个包装质粒（psPAX2 和pMD2. G）分别转染至HEK293T 细胞。转染3 h 后更换为完全培养基，48 h 后收集病毒上清并用0.45 μm 滤器过滤，滤液置于-80 ℃保存备用。

1.4 MCM2、MCM6 基因沉默稳定胰腺癌细胞的建立 取对数生长期PANC-1 细胞接种到6 cm 培养皿中，待细胞融合度为50% 左右，分为对照组、shMCM2、shMCM6 组，分 别 加 入1 mL Scramble、shMCM2、shMCM6慢病毒溶液和终浓度为8 μg/L的polybrene。病毒感染24 h 后，更换含2 mg/L 嘌呤霉素的培养基进行筛选。采用Western blotting 法检测三组MCM2、MCM6 蛋白表达，结果显示，shMCM2 组MCM2 蛋白表达低于对照组（0.31 ± 0.13 vs 1.11 ± 0.16，P＜0.01），shMCM6 组MCM6 蛋白表达低于对照组（0.62 ± 0.03 vs 1.06 ± 0.07，P＜0.05），表明MCM2和MCM6基因沉默稳定细胞系构建成功。

1.5 细胞增殖能力观察 采用CCK-8 法。取三组细胞，配制成细胞悬液，按每孔100 μL 接种至96 孔板，每组设3 个复孔。培养0、24、48、72 h 后，加入10 μL CCK-8 试剂孵育3 h，在酶标仪450 nm 处检测相应的OD 值，并绘制增殖曲线。将各组0 h 测得的OD 值设1，其他时间点进行OD 值归一化，计算细胞增殖率。

1.6 细胞横向迁移能力观察 采用细胞划痕实验。取三组细胞，以3×105/孔接种于6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞融合度为100%时，更换为无血清培养基，饥饿培养3 h。用1 mL枪头垂直于6孔板划痕，分别于0 h和24 h在相同位置拍照，Image J 软件分析划痕面积，计算面积比，代表细胞横向增殖能力。

1.7 细胞纵向迁移能力观察 采用Transwell实验。在Transwell 孔 板 下 室 加 入600 μL 含15% FBS 的DMEM，上室加入100 μL 含4×104个细胞的无血清DMEM 细胞悬液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。加入0.1%结晶紫染色15 min，在4 倍镜下任意选取5个不同视野拍照，用Image J软件进行分析。以穿过Transwell小室膜的细胞数目除以接种的总细胞数目计算细胞迁移率，代表细胞纵向迁移能力。

1.8 细胞周期蛋白Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA 检测 采用RT-qPCR 法。取三组细胞接种于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞融合度达到100%，提取总RNA，逆转录合成cDNA。使用SYBR Green 试剂进行实时定量PCR 检测Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA 表达。引物序列见表1。反应条件：95 ℃变性2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40 个循环。以GAPDH 为内参，通过目的基因的Ct 值，以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，同时将对照组的各种细胞周期蛋白mRNA 相对表达量标准化为1，实验组进行归一化处理。

1.9 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。数据均来自3 次独立重复实验，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用Student′st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组细胞增殖率比较 随着培养时间延长，三组细胞活性均不断增加，shMCM2 和shMCM6 组在72 h的细胞增殖率低于对照组（P均＜0.01）。见表2。

表2 三组不同时间点细胞增殖率比较± s）

表2 三组不同时间点细胞增殖率比较± s）

注：与对照组比较，*P＜0.01。

组别shMCM2组shMCM6组对照组细胞增殖率24 h 2.34 ± 0.30 2.48 ± 0.40 2.81 ± 0.72 48 h 4.04 ± 0.53 4.33 ± 0.39 4.92 ± 0.31 72 h 4.71 ± 0.25*5.01 ± 0.47*6.87 ± 0.40

2.2 三组细胞迁移能力比较 与对照组相比，shMCM2组细胞横向迁移的划痕面积比和纵向迁移率均降低（P均＜0.01）；shMCM6 组细胞横向迁移的划痕面积比与对照组比较无统计学差异（P＞0.05），纵向迁移率低于对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 三组细胞迁移能力比较（± s）

表3 三组细胞迁移能力比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别shMCM2组shMCM6组对照组划痕面积比0.93 ± 0.03**0.85 ± 0.06 0.73 ± 0.06纵向迁移率（%）6.79 ± 1.13**8.48 ± 1.03*10.53 ± 1.11

2.3 三组细胞Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA表达水平比较 与对照组相比，shMCM2组Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA 表达水平降低，shMCM6 组Cyclin A1、B1 mRNA表达水平降低（P＜0.05或＜0.01）。见表4。

表4 三组细胞Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA表达水平 比较（ s）

表4 三组细胞Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA表达水平 比较（ s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别shMCM2组shMCM6组对照组Cyclin A1 mRNA 0.18 ± 0.07**0.29 ± 0.22**1.00 ± 0.00 Cyclin B1 mRNA 0.55 ± 0.22*0.57 ± 0.15**1.00 ± 0.00 Cyclin D1 mRNA 0.32 ± 0.02**1.04 ± 0.30 1.00 ± 0.00 Cyclin E1 mRNA 0.73 ± 0.01*0.97 ± 0.18 1.00 ± 0.00

3 讨论

胰腺癌早期症状不明显，缺乏相应的关键标志物，大部分确诊时已至晚期，预后极差。研究显示，胰腺癌组织中MCM2～7表达上调［10］；通过瞬时转染降低胰腺癌细胞MCM4、MCM7 表达可增加细胞对吉西他滨和5-FU 的药物敏感性［11］。在近期的数据库筛选结果中发现，MCM2 可作为胰腺癌的诊断和预后的潜在生物标志物［12］。然而，胰腺癌细胞易于增殖及转移等机制尚未阐明，广泛高表达于各类癌细胞中的MCM 复合物能否作为胰腺癌新型的治疗靶点，成为近年研究热点。

细胞的恶性增殖和高的迁移侵袭能力，是恶性肿瘤细胞的重要生物学特性，与肿瘤的发展进程密切相关。细胞MCM 蛋白表达与多种肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力有关［13-16］。研究表明，在肺癌细胞中瞬时敲低MCM2 基因，其细胞增殖能力和迁移能力均降低［17］。LIU 等［18］研究显示，在肝癌细胞中沉默MCM6基因能够抑制肝癌细胞的体外增殖和迁移能力，进一步研究发现MCM6 是通过激活MEK/ERK 信号通路发挥促肿瘤作用，进而调节肝癌的转移和上皮间质转化。体内外研究显示，敲低MCM7能够抑制胶质母细胞瘤和肝癌细胞的增殖［19-20］。在髓母细胞瘤中，过表达MCM2、MCM3 和MCM7 能够显著增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而敲低MCM2、MCM3 和MCM7 均不同程度降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力［13］。本研究结果显示，沉默PANC-1 细胞中的MCM2 或MCM6 均可抑制胰腺癌的增殖和迁移能力，说明MCM 蛋白在促进胰腺癌发生发展中具有重要作用。

多项研究报道了MCM2～7 参与细胞周期及信号通路的调节。在非小细胞肺癌中，MCM2 沉默诱发细胞G1/S 期阻滞，抑制了Cyclin D1 和CDK4 表达，但上调了p21 和p53 表达，表明MCM2 缺失可导致细胞周期停滞，阻碍肿瘤细胞增殖［21］。瞬时沉默肝癌细胞中的MCM6 可下调CyclinA、B1、D1、E 表达，延缓细胞S/G2期的进展，从而抑制细胞增殖［5］。在肝癌细胞中，MCM7 表达与Cyclin D1 表达相关［20］；在食管鳞状细胞癌中，敲低MCM7 能够降低Cyclin D1、Cyclin E2 表达，同时抑制AKT 和mTOR磷酸化［22］。本研究结果显示，沉默MCM2 表达能够使胰腺癌PANC-1 细胞Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA表达降低，而沉默MCM6 表达可使细胞Cyclin A1、B1 mRNA表达降低。提示MCM复合物抑制PANC-1细胞增殖和迁移的作用可能是通过下调细胞Cyclin mRNA表达引起细胞周期阻滞造成的。

综上所述，MCM 复合物蛋白缺失可降低胰腺癌PANC-1细胞的增殖和迁移能力，其机制可能是通过降低细胞Cyclin mRNA 表达来发挥作用。目前，已经有靶向MCM2～7表达以及MCM2～7解螺旋酶活性的小分子抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的报道［23］，说明靶向MCM 复合物治疗肿瘤是一种新型的有潜力的治疗策略。后续我们将继续研究MCM 复合物对胰腺癌细胞信号传导通路的影响，进一步了解MCM 蛋白在胰腺癌发生发展中的作用，为其成为胰腺癌诊断及治疗的分子靶点提供理论基础。