利用扫描电子显微镜分析声波辅助根管荡洗作用时间对玷污层清理效果的影响

肖 敏，刘 瑾，范晓敏，吴昊泽，王珏钰，王可境，李 娜，蒋文凯，梅笑寒

在根管预备过程中，由根管器械切割产生的牙本质碎屑与冲洗液和残留的有机组织混合，会形成玷污层黏附于根管壁上。这种玷污层由两部分组成：第1层为1～2 μm，由有机物和牙本质碎屑组成；第2层为延伸至牙本质小管内40 μm处，主要为牙本质碎屑[1]。大量研究证明玷污层可能含有细菌，将影响后续根管消毒的效果。去除玷污层能有效提高牙本质的渗透性，进而增强根管内药物的作用，使得充填材料可以深入侧支根管和牙本质小管内[2]。然而，目前还没有一种冲洗剂能够同时作用于玷污层的有机和无机元素。因此，为了有效去除玷污层，学者们提出了多种解决方案。目前最有效的方法为17%的EDTA作用1 min，去除玷污层并使牙本质小管口开放，而作用时间过久可能会导致牙本质胶原纤维的过度脱矿，从而降低牙齿的抗力性[3]。

动能辅助冲洗设备可提高根管冲洗的效率。近年新上市的声波荡洗设备(EDDY，6 kHz，VDW公司，德国)是由高分子聚合材料制成的工作尖和声波手机构成，主要作用是振荡根管内的冲洗液[4]。由于该产品在2015年才投放市场，到目前为止只有少量的相关研究。国内仅有学者研究了它对根管内氢氧化钙封药清除的效果[5]，对于其去除玷污层和杀菌效果的研究尚不完整。本课题组在之前的实验中使用了侧方冲洗针头、超声、EDDY、激光4种方法配合次氯酸钠和EDTA溶液进行根管荡洗，通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope， SEM)观察发现，EDTA和次氯酸钠溶液配合使用EDDY各作用30 s，去除玷污层的效果最明显，而EDDY组样本的牙本质小管口直径有明显扩大，提示使用EDDY荡洗根管的时间还需进一步研究[6]。

本实验使用EDDY声波设备辅助17%EDTA溶液冲洗根管，通过SEM观察不同作用时间下根管上、中、下段根管壁玷污层的清除情况，以明确临床中使用EDDY荡洗根管的最佳时间。

1 材料与方法

选择由第四军医大学第三附属医院齿槽外科门诊拔除的56颗单直根管前牙，要求牙齿无龋坏，牙根完整，从未经过牙髓治疗，并拍摄X线片，确定根管影像清晰无钙化或内吸收。本研究经第四军医大学口腔医院伦理委员会审查批准(批准号： IRB-REV-2021019)，所有患者均签署知情同意书。

使用金刚砂车针磨除釉牙骨质界以上的牙冠，保留至少12 mm长度的牙根。拔髓针去除根管内大块牙髓组织，使用15#K锉(K-file，MANI公司，日本)疏通根管并确定牙根长度，根管单支锉(WaveOne Gold，登士柏西诺德公司，瑞典)冠向下法预备根管至40.04#。随后将所有牙根根据冲洗剂的不同分为2个实验组：生理盐水组，EDTA组。再根据荡洗时间将EDTA组分为6个亚组(5 s，10 s，20 s，30 s，40 s，50 s)，生理盐水组分为3个亚组(5 s，30 s，50 s)，每个亚组6颗，对照组2颗不进行根管冲洗和荡洗。

整个操作由同一位医生完成，一位助手辅助增添冲洗液。

使用高速涡轮手机金刚砂车针在牙根磨出两条浅沟，确保不涉及根管系统，然后用骨钳纵向剖开每段牙根。用2.5%戊二醛溶液固定24 h，PBS冲洗10 min，用20%、40%、60%、80%、90%和100%浓度的乙醇梯度脱水，每种浓度各10 min，六甲基二硅胺烷干燥24 h，喷金后通过SEM观察。首先在低倍率(30倍)下观察样本以获得概貌，再放大1 000倍对典型区域进行重点检查，以评估是否存在玷污层。全部操作均由两名经过SEM研究培训、完全熟悉SEM图像的医生依次独立进行，他们并不知晓根管的预备和冲洗过程。根管表面采用Caron等的评分标准[7]进行评估，1分：无玷污层且牙本质小管开放；2分： 可见少量散在玷污层且牙本质小管开放；3分： 可见薄层玷污层，牙本质小管部分开放(典型的新月形外观)；4分：可见部分牙本质壁被较厚的玷污层覆盖；5分：可见牙本质壁完全被厚的玷污层覆盖。若两位观察员的评判结果不一致，则记录较低的分值。

使用 SPSS 19．0 统计软件对数据均数±标准差进行方差分析(ANOVA)， 两两比较用Tukey′s多组比较法进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

通过扫描电子显微镜观察根管内壁表面，可以发现当根管机械预备后根管壁全段会被玷污层完全覆盖，无法观察到牙本质小管口(图1)。

a1～a3： ×1 000;A1～A3： ×3 000

使用生理盐水+EDDY进行根管荡洗，作用5 s后，根管全段仍可见明显的玷污层，与对照组差异无统计学意义；作用30 s后，根管冠方1/3可见部分被玷污层覆盖的牙本质小管，与对照组及处理5 s组差异有统计学意义(P<0.05)，然而根中和根尖1/3仍存在较厚的玷污层，与对照组相比无明显差别；作用50 s后，根管冠方1/3可见较清晰的牙本质小管口，仅有少量散在的玷污层，根中下段可见部分被较薄的玷污层覆盖的根管口，与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

a1～a3，b1～b3，c1～c3： ×1 000;A1～A3，B1～B3，C1～C3： ×3 000；&：与其他各组相比P<0.05；Con：对照组

使用EDTA+EDDY根管荡洗，作用5 s后，可见根管中上2/3的根管壁上有薄层玷污层，牙本质小管口基本敞开，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，而根尖区仍可见牙本质小管被较厚的玷污层覆盖，与对照组相比差异无统计学意义；作用10 s后，可见根管中上段牙本质小管基本开放，仅有散在的较薄玷污层，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，且冠1/3荡洗效果与作用5 s组相比存在统计学差异(P<0.05)，而根尖区作用效果不明显；作用20 s组与作用10 s组根管中上段无明显差别，根尖区与对照组、5 s、10 s组相比均存在统计学意义(P<0.05)；作用30 s后，冠方可见清晰的牙本质小管口，根中段仅有少量散在的玷污层，而根尖段仍可见被玷污层部分覆盖呈新月状的牙本质小管，与20 s组相比无明显差别；作用40 s后根管全段玷污层评分与30 s组无明显差异；作用50 s后，根管全段均可见清晰的牙本质小管口，根尖区仅有少量散在的玷污层，与其他各组相比有明显的统计学差异(图3)。

a1～a6，b1～b6，c1～c6： ×1 000;A1～A6，B1～B6，C1～C6： ×3 000；*：与对照组(Con组)相比P<0.05；#：与Con组、5 s组相比P<0.05；@：与Con组、5 s组、10 s组相比P<0.05；&：与其他各组相比P<0.05

对比生理盐水组和EDTA组根管荡洗50 s后玷污层清理情况，可以看出两组均对玷污层有明显的清理效果，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；两组间比较可见EDTA组对玷污层清理效果更明显，与生理盐水组及对照组相比均有明显的统计学差异(P<0.05)(图4)。

同部位三组之间差异均有统计学意义；Con：对照组

3 讨 论

根管治疗的主要目的是清除根管内感染，而根管内感染主要来源于微生物感染及玷污层[8]。为了尽可能去除根管内感染，根管预备器械更新换代，但是研究表明，预备器械只能到达约50%根管内解剖结构，那些微小、狭窄的结构仍无法触及[9]。更有研究报道根管预备器械的旋转及往复运动可能将碎屑推向这些狭小的位置[10]，增加根管清理的难度，同时在后期治疗中也会阻碍根管消毒剂及根管封闭剂进入牙本质小管及侧枝根管[11]。因此，根管冲洗对进一步提高整个根管系统的清洁和消毒至关重要，它不仅能够清除根管内感染的牙髓组织，中和或去除细菌及其代谢产物，还能清理根管预备过程中产生的碎屑，去除玷污层[12]。研究表明，在根管冲洗过程中联合使用次氯酸钠及EDTA能够有效去除机械预备过程中形成的玷污层。EDTA 能够软化和溶解无机的牙本质碎屑，它既能避免碎屑在根管壁上的积聚又能立即清除刚附着的碎屑[13]；而次氯酸钠可溶解根管内坏死组织以及玷污层中的有机物，抑制或杀灭生物膜和牙本质小管中的病原微生物，降低内毒素活性[14]。由于玷污层中主要成分为无机物，所以清理玷污层主要依赖于EDTA的作用。在本课题组先前的实验中[6]我们对离体牙进行严格灭菌处理后重新细菌培养，证明了EDDY+EDTA+次氯酸钠配合使用荡洗根管后的杀菌和清除玷污层的作用是切实有效的，所以本次实验将重点定位于玷污层，一方面探究合理的作用时间，既能快速清除玷污层又不会导致牙本质结构的破坏，另一方面测试在不使用螯合剂的情况下，仅依靠声波的声流和空穴效应是否可以有效清除玷污层。因为仍有部分医疗机构，尚未在临床中普及使用EDTA等液剂型螯合剂，我们需要寻找不使用螯合剂时有效清理玷污层的方法以达到良好的治疗效果。

由于牙齿解剖结构变异，以及根管内根尖部分滞留的根尖周组织和空气可能会阻碍冲洗剂的冲洗效果[15]，通过常规的手动冲洗方法，冲洗剂很难达到根尖1/3及根管峡部等部位，因此临床上常用超声、激光、声波等辅助手段，通过活化冲洗剂使其进入根管深层从而提高根管的冲洗效果[16]。声波辅助冲洗设备EDDY因其频率高达6 000 Hz，能够激活冲洗液，在去除根管内玷污层和减少细菌负荷方面具有显著的潜力[17]。此外，EDDY的工作尖主要由高分子聚合材料制成，当在根管荡洗过程中与根管壁接触时不会停止工作，同时也不会破坏根管壁，在弯曲的根管中使用具有较高安全性[18]。

本研究通过模拟临床根管治疗临床步骤，采用常规根管预备方法(冠向下法)进行根管预备，而后进行根管冲洗。为了确保冲洗液输送至工作长度，并有足够的空间来保证足量冲洗剂流量，本实验使用WaveOne Gold根管锉将根管预备至40.04#。研究表明，在该直径和锥度下的根管能够允许足够的冲洗剂交换，为根尖区冲洗剂的激活提供足够的空间，同时不会造成任何摩擦[19]。为了避免根管直径和机械预备时间对玷污层产生的影响，实验前仔细选择牙齿，操作过程在标准模式下进行，并统一机械预备的时长。在终末冲洗时，选择尺寸合适的冲洗针头，确保冲洗针头顶端可置于距根尖2 mm处，每组牙根给予5 mL冲洗液。以此排除标准条件以及溶液用量的影响，实验结果的差异就可以通过溶液作用于牙本质壁的不同时间来解释。有学者证明17%EDTA作用1.0和1.5 min后，离体牙的显微硬度随时间增加有所下降[20]，故将实验组的最长作用时间控制在50 s，以避免牙体结构的破坏。经过分组处理后，将样本置于SEM观察根管表面的碎屑，通过形态学观察根管表面，可看到未接受终末冲洗的牙本质表面被玷污层覆盖。对各实验组及对照组的玷污层进行评估。

本次实验结果表明仅使用生理盐水进行根管冲洗时，由于EDDY产生的空穴效应和声流作用，对玷污层仍有一定的清洁效果，然而需保证充足的荡洗时间[21]。根据电镜图片可以看出作用5或30 s时清洁效果并不明显，作用50 s时，根管中上段的玷污层明显减少，冠方1/3可见清晰的牙本质小管，中段仅有少部分牙本质小管被玷污层覆盖，根尖区域牙本质小管亦部分敞开。肖芳等[22]使用0.5%次氯酸钠作为冲洗剂配合EDDY进行根管荡洗60 s后发现，根尖区仍有部分玷污层覆盖牙本质小管，玷污层评分与本实验中生理盐水50 s组相当。当使用EDTA作为冲洗剂时，配合EDDY荡洗5或10 s，根管中上段即可获得基本开放的牙本质小管口，然而根尖区仍有较厚的玷污层覆盖；作用20～30 s后，根管中上段的牙本质小管即可完全敞开，仅有部分散在的玷污层，且根尖区的牙本质小管口也部分敞开，Plotino等[12]将根尖预备至25#，使用EDTA+EDDY作用20 s后根尖区仍有较明显的玷污层；作用40～50 s后，根尖区的玷污层也可得到有效的清除，Rius等[23]实验中使用EDDY+EDTA作用60 s，根尖区亦可见开放的牙本质小管口，与本实验结论基本一致。

综上所述，本研究提示当患者因牙髓炎就诊时，根尖区为非感染根管，可选择使用EDTA+EDDY荡洗根管10～20 s，不仅保证根管中上段的清理效果，也可减少操作时间；当患牙为感染性根管时，为提高化学预备的效果，建议使用EDTA+EDDY荡洗根管30～50 s，确保根尖区的牙本质小管开放，有利于接下来根管消毒药物的渗透[24]。若无条件应用EDTA时，则建议延长EDDY的使用时间至1 min以上。