MALDI-TOF技术在重症肺炎痰液样本病原菌检测和鉴定中的应用

刘亚荣 罗军 李冰瑶

（1. 电子科技大学医学院附属绵阳医院，四川 绵阳 621000；2. 绵阳市中心医院医学检验科，四川 绵阳621000）

重症肺炎作为一种常见的急危重症，具有发病率高、病情进展迅速等特点，易危及患者生命安全[1]。重症肺炎多由毒力极强的革兰阳性或阴性菌感染所致，病情严重，进展迅速，常发生各种严重并发症，如不及时救治，可危及生命。因此，快速检测鉴定重症肺炎患者病原菌类型，以采取针对性抗生素治疗成为临床备受关注的问题[2]。传统的病原菌鉴定通常采用菌落形态、染色、显微镜检查、趋向性试验以及自动化鉴定仪等鉴定方法，但其操作过程繁琐、鉴定时间过长、主观性较强，不能及时提供病原学诊断结果。因此，寻找一种快速、可靠的病原菌鉴定方法对临床病原学诊断具有重要意义。基质辅助激光解吸电离飞行时间（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF）技术是近年来飞速发展起来的一种新型软电离质谱技术，主要用于微生物鉴定，MALDI-TOF技术主要原理是利用不同菌种核糖体蛋白大小存在差异，通过检测病原菌保守且独特的蛋白峰特征性质图谱，将检测所得图谱与已知菌种数据库参考图谱作对比，以得到病原菌鉴定结果[3,4]。该技术具有方便、快速、高通量、特征性强且实验成本较低等优点，已在微生物领域尤其是细菌鉴定中得到广泛运用[5]。然而目前该技术在肺炎痰液样本病原菌临床检测中应用研究较少，对此，本研究通过将MALDI-TOF技术与VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统（VITEK 2 Compact automatic microbial analyze，VITEK-2）鉴定技术进行比较，以观察MALDI-TOF技术在重症肺炎痰液样本病原菌检测和鉴定中的实际应用效果，旨在为临床及时进行抗感染治疗提供有利参考，现将其过程整理报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2021年7月至2021年12月收治的214例重症肺炎患者为研究对象，其中男126例，女88例；平均年龄44.17±11.62 岁；平均病程4.81±0.74 d。

纳入标准：诊断为重症肺炎患者[6]；患者均进行痰液样本培养、检测；患者了解并愿参与此次研究。排除标准：恶性肿瘤患者；合并血液系统性疾病者；感染病患者。本研究经医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 基因测序

提取晨起时患者痰液样本病原菌菌株，使用DNA提取试剂盒（赛默飞世尔科技(中国)有限公司）提取病原菌菌株DNA，将提取的DNA使用核酸溶度测定仪进行测序，操作方法严格按试剂盒以及仪器说明书进行，结果与基因库NCBI GenBank已知序列同源性比较，确定病原菌种类。

1.2.2 全自动微生物鉴定VITEK-2技术鉴定

将痰液样本病原菌菌株接种至琼脂平板上，37℃培养24 h，选取单一菌落进行革兰染色，根据其病原菌生长特征和染色性，由梅里埃VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统进行检测，检测结果与配套的GN鉴定板进行对比，确定病原菌种类，鉴定方法选择严格按照实验室操作说明书进行。

1.2.3 MALDI-TOF技术鉴定

挑取痰液样本病原菌菌落，不要带有任何琼脂，靶板涂抹，涂一个点位或两个点位后立刻加入 1 μLα-氰 基-4-羟 基 肉 桂 酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）基质，同时涂点样校准菌株大肠埃希菌 ATCC 8739，待样本干燥后，使用梅里埃MALDI-TOF生物质谱仪进行检测，操作方法参考仪器说明书。检测结果与MALDI Biotyper 3.0数据库进行比对，样本图谱与数据库中的相应菌株图谱高度相似时确定病原菌种类。其他注意事项：所有操作过程均应遵守实验室生物安全要求以及相应无菌操作；涂菌时注意涂菌量，过多或过少均会影响鉴定结果；每个靶板有48个点位，16个点位为一组，可分3次使用，每组中心的小点位用于涂校准菌株。

1.3 观察指标

①以基因测序法为“金标准”，比较两种检测方法对病原菌的鉴定结果。②对比其他两种检测技术对病原菌的鉴定率。③对比其他两种检测技术对病原菌的鉴定结果的差异性，包括对病原菌的鉴定准确率、漏诊率、误诊率，其中鉴定准确率=已鉴定出的正确菌群数量/菌群总数量×100%，漏诊率=未鉴定出的菌群数量/菌群总数量×100%，误诊率=鉴定错误菌群数量/菌群总数量×100%。

1.4 数据分析

采用SPSS21.0软件进行数据分析，计数资料使用例（n）或百分数（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种检测方法对病原菌的鉴定结果

三种检测方法对金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头部葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌、不动杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽杆菌、其他类型病菌等病原菌的鉴定结果见表1。

表1 三种检测方法对病原菌的鉴定结果（n（%））

2.2 两种检测技术对病原菌的鉴定率比较

两种检测技术对病原菌各类菌种的鉴定率比较见表2。

表2 两种检测技术对病原菌的鉴定率比较（n（%））

表3 两种检测技术对病原菌的鉴定结果差异比较（n（%））

2.3 两种检测技术对病原菌的鉴定结果差异比较

MALDI-TOF技术对重症肺炎痰液样本病原菌的总鉴定率明显高于VITEK-2技术，差异有统计学意义（P＜0.05），两组检测技术漏诊率比较差异无统计学意义（P＞0.05），MALDI-TOF技术对重症肺炎痰液样本病原菌误诊率明显低于VITEK-2技术，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

临床研究指出MALDI-TOF技术能快速、准确地鉴定出病原菌病原学信息，且实验成本较低，在临床检测和鉴定中存在一定优势[7]。在本次研究中，MALDI-TOF技术对重症肺炎患者痰液样本病原菌鉴定准确率明显高于VITEK-2技术，这与孟令缘等[8]研究结论相类似。分析其原因，MALDI-TOF技术通过将痰液病原菌样本和CHCA基质混合，利用激光作为能量来源，辐射病原菌标本与基质共结晶，基质吸收激光能量传递给病原菌蛋白质，使其发生电离；因离子飞行时间与质量呈正比，经过飞行时间检测期，到达检测器后，根据不同离子飞行时间的不同而形成质量图谱，再将其与质谱图数据库的已知特征质谱图作对比，筛选并确定特异性图谱，从而实现对病原菌的区分和鉴定[9,10]。

MALDI-TOF技术以病原菌表面蛋白为检测对象，受培养基、培养时间以及其他培养条件等外部因素影响较小，具有较好的稳定性和可重复性；还能对未经纯化的样本进行检测鉴定，节省了培养时间，使得临床医师可根据鉴定结果，及时为患者提供抗生素治疗[11]。本研究结果显示，两组检测技术漏诊率比较差异无统计学意义，但MALDI-TOF技术对重症肺炎痰液样本病原菌鉴定误诊率明显低于VITEK-2技术，这与李曲文等[12]研究结果相类似。这可能是因为在重症肺炎痰液样本中，病原菌复杂，且存在其他大量干扰物质，使得广谱采集不准确，进而影响MALDI-TOF技术检测敏感度。实际检测可通过样本通过浓缩、微量化等步骤在提高其敏感度，但却会以增加样本处理时间和成本为代价。并且在实际临床检测过程中，VITEK-2技术还可进行相应药敏测试分析，以检测病原菌对相应抗菌药物的耐药情况，而MALDI-TOF技术无法分析病原菌对抗菌药物的敏感情况，无法为临床急性靶向抗感染治疗提供准确的药物使用方案。综上所述，在重症肺炎痰液样本病原菌检测和鉴定中，MALDI-TOF技术能快速为临床提供高度可信的病原菌鉴定结果。然而该检测技术还存在一定不足之处，因无法代替经典的抗菌药物敏感性试验，仅能为临床做出一定的抗感染指导，无法为临床医生急性靶向抗感染治疗提供准确依据。