Slc7a11通过E-cadherin/β-catenin信号通路诱导自噬促进乳腺癌细胞侵袭转移的作用机制研究#

李晓华 郭欣怡

（1. 福建医科大学附属福州市第一医院乳腺外科，福建 福州 350009；2. 福建医科大学附属协和医院普通外科，福建 福州 350009）

乳腺癌是全世界妇女常见的恶性肿瘤之一，在我国女性恶性肿瘤中的发病率也排在第一位[1]。细胞迁移和侵袭在乳腺癌中已被肿瘤研究者广泛研究，具体发生机制尚未可知，所以对其迁移侵袭的机制值得我们深入探讨。细胞黏附分子的异常表达意味着肿瘤的侵袭转移[2]，整合素家族、选择素家族，免疫球蛋白超家族及钙黏素超家族这些都属于与细胞迁移相关的黏附分子。E-钙黏蛋白（E-cadherin）主要在各种上皮组织中表达，是参与细胞之间黏附连接的Ca2+依赖性跨膜糖蛋白，它通过与β-连环蛋白（β-catenin）形成稳定的复合物发挥相互黏附作用，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭[3]。重组蛋白溶质载体家族7成员11（Solute carrier family7 member11，Slc7a11）位于细胞膜上，它的主要作用是将胞外的胱氨酸转运到胞内，胱氨酸在胞内迅速被还原为半胱氨酸[4]。多项研究表明[5,6]，Slc7a11在乳腺癌组织中的高表达在介导乳腺癌细胞铁死亡方面发挥着重要作用。目前关于Slc7a11促进乳腺癌细胞侵袭和转移的机制尚未有研究，Slc7a11与介导肿瘤细胞侵袭和转移高度相关的E-cadherin/β-catenin信号通路是否有关也尚未可知。本研究拟通过Slc7a11在人乳腺癌细胞中，对迁移及黏附分子相关蛋白表达的调控情况，探讨Slc7a11对人乳腺癌细胞侵袭迁移的影响，为临床上治疗乳腺癌肿瘤提供参考价值

1 材料与方法

1.1 细胞

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231于中国科学院细胞库上海生命科学研究院生化与细胞研究所购入。

1.2 仪器与试剂

高糖 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液及青霉素-链霉素抗生素均购自Gibco公司，二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxid，DMSO）和兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体购自Sigma公司，E-cadherin（Cat No：3195）和兔单克隆抗体β-catenin（Cat No：8480）购自美国CST公司，Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG过表达质粒由安徽通用生物股份有限公司合成，其中耗材包含Transwell小室（8 μm）、24孔板、培养皿（美国Coring公司），仪器包含Bio-Rad成像仪、Thermo CO2培养箱、尼康倒置相差显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与转染

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、1%青霉素-硫酸链霉素的高糖DMEM培养基中放置在37℃、5%二氧化碳（Carbon dioxide，CO2）培养箱内培养，每天在显微镜下观察生长情况，密度达到85%即可传代。冻存一定数量的人乳腺癌细胞后，可进行转染实验，先将MDA-MB-231少量接种于6孔板中，观察细胞生长密度达到80%后用Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG转染质粒，其中一组转染过表达Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG质粒（Slc7a11过表达组），一组转染sh-Slc7a11质粒（干扰Slc7a11表达组），一组不转染质粒作为对照组，其余实验操作保持一致。每孔转染4 μg，并用新霉素筛选阳性克隆用于后续实验。

1.3.2 Western blotting检测

细胞在六孔板中长满后提取细胞总蛋白，加入上样缓冲液后涡旋30 s混匀后，将金属煮沸仪调至95℃，加热样品5 min，使蛋白煮沸变性，酶标仪测定计算蛋白浓度。Western blotting免疫印记操作步骤如下：每孔上样量为30 μg，进行SDS-PAGE电泳1 h，结束后进行转膜，提前裁剪好适宜大小的聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，转膜时调节电压为120 V恒压转移至PVDF膜 1 h，用5%的脱脂奶粉放在摇床上均匀封闭1 h，封闭结束后TBST洗膜进行裁剪，然后加入一抗（1:1000）放置4℃冰箱中孵育过夜，第二天以TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1:10000）在室温摇床上孵育2 h，以化学发光法显影。

1.3.3 迁移实验

迁移实验前一天先用无血清培养基饥饿细胞24 h。用胰酶消化细胞，当在显微镜下细胞形态缩小有少量飘起立刻用培养基终止消化，离心并小心吸弃上层培养液，用磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffered saline，PBS）清洗两遍，用无血清培养基重悬后在显微镜下计数，调整细胞密度至2×105个·mL-1。取200µL细胞悬液加入24孔板Transwell小室的上室，下室加入500 µL含20% FBS的高糖培养基，放置37℃培养箱培养48 h后，取出Transwell小室用4%的多聚甲醛溶液室温固定15 min，吸弃多聚甲醛溶液并加入0.5 mL的结晶紫溶液染色30min，用棉球将上室细胞擦去后在显微镜下观察，随机选取6个视野记录迁移细胞数量。

1.3.4 侵袭实验

人乳腺癌细胞用胰酶消化后，用无血清DMEM培养基终止消化，调整细胞密度为1×105个·mL-1。在Transwell小室中铺好基质胶，下室加入含20%FBS的高糖培养基500 µL，上室加入200µL细胞悬液。放入培养箱培养72 h后，用4%多聚甲醛溶液室温固定15 min，吸弃多聚甲醛溶液并加入0.5 mL的结晶紫溶液染色30 min，用棉球将上室细胞擦去后在显微镜下观察，随机选取6个视野并记录侵袭细胞数。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差（±SD）表示，组间两两比较采用t检验；计数资料以例数（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达Slc7a11促进乳腺癌细胞的侵袭和转移

Western blotting 实验结果显示，与对照组比较，过表达Slc7a11组E-cadherin和β-catenin蛋白表达明显降低（P＜0.05）。Transwell小室细胞体外迁移侵袭实验发现，穿过细胞小室的细胞数量明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 Slc7a11 基因过表达后对MDA-MB-231细胞侵袭转移的影响（±SD，n=3）

表1 Slc7a11 基因过表达后对MDA-MB-231细胞侵袭转移的影响（±SD，n=3）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

分组 细胞迁移数(个) 细胞侵袭数(个) Slc7a11 E-cadherin β-catenin对照组 108.00±11.67 79.99±11.99 1.00±0.04 1.03±0.05 1.10±0.06 Slc7a11过表达组 309.67±12.50* 287.33±11.70* 3.80±0.02* 0.43±0.05* 0.67±0.09*

2.2 干扰Slc7a11促进MDA-MB-231细胞的侵袭和转移

Transwell小室细胞体外迁移侵袭实验和Western blotting检测结果显示，与对照组比较，干扰Slc7a11组E-cadherin和β-catenin蛋白表达明显升高（P＜0.05），穿过细胞小室的细胞量明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 干扰SLC7A11基因表达后对MDA-MB-231细胞侵袭转移的影响（±SD，n=3）

表2 干扰SLC7A11基因表达后对MDA-MB-231细胞侵袭转移的影响（±SD，n=3）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

分组 细胞迁移数(个) 细胞侵袭数(个) Slc7a11 E-cadherin β-catenin对照组 262.337±12.05 214.33±12.05 1.00±0.04 1.00±0.05 1.10±0.05干扰Slc7a11表达组 60.33±12.50* 46.67±13.94* 0.41±0.03* 1.73±0.10* 1.61±0.03*

2.3 过表达Slc7a11诱导乳腺癌细胞自噬水平

MDA-MB-231细胞过表达Slc7a11后，自噬相关基因Beclin-1和LC3II的表达明显上调（P＜0.05），p62表达明显降低（P＜0.05）。详见表3。

表3 Slc7a11 基因过表达后对MDA-MB-231细胞自噬蛋白的影响（±SD，n=3）

表3 Slc7a11 基因过表达后对MDA-MB-231细胞自噬蛋白的影响（±SD，n=3）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

分组 Slc7a11 Beclin-1 LC3II p62对照组 1.00±0.04 1.03±0.20 1.09±0.18 1.03±0.08 Slc7a11过表达组 0.41±0.03* 1.67±0.21* 1.76±0.02* 0.63±0.27*

3 讨论

恶性肿瘤后期表现为易扩散且易转移，因此临床上肿瘤患者常常治疗无果，需要继续二线治疗。当外界各种理化刺激因素或者自身致病因素导致同质细胞间黏附性降低时，肿瘤细胞都有可能从瘤块脱落并向其他部位迁移，从局限期转变为广泛期[7]。本实验研究发现，在侵袭性的MDAMB-231中过表达Slc7a11，与对照组相比，Ecadherin和β-catenin两个黏附蛋白明显降低，侵袭转移能力明显升高；与此同时，自噬相关蛋白Beclin-1和LC3II的表达上调，而p62表达降低。当干扰Slc7a11基因时，E-cadherin和β-catenin蛋白表达明显上升，侵袭转移细胞数明显降低。以上结果表明Slc7a11能够调控细胞自噬促进乳腺癌细胞侵袭和转移，其主要机制可能与其下调细胞黏附分子E-cadherin/β-catenin复合体表达有关。

据研究报道，钙黏蛋白家族中的E-cadherin蛋白与β-catenin蛋白共同构成的E-cadherin/βcateninn复合体是完成细胞间黏附的重要黏附分子[8]。E-cadherin蛋白的表达与妇女乳腺癌的发生发展密切相关，且E-cadherin蛋白量表达越低，淋巴结转移数量越多[9]，妇女乳腺癌转移重要的生物学标志之一即E-cadherin蛋白表达的下调或缺失[10]，通过检测E-cadherin蛋白表达情况来对早期乳腺癌患者的诊断并制定个体化治疗方案具有重要的意义。如果通过干预使E-cadherin表达正常或提高其表达，对肿瘤的侵袭转移可以起到有效抑制作用，成为降低肿瘤初始治疗后转移复发的新的治疗靶点。β-catenin作为一种可溶性蛋白在肿瘤细胞免疫抵抗中奠定了重要得生物学功能基础，主要存在于细胞膜上，在细胞质则以游离型和结合型两种形式存在。β-catenin在正常上皮细胞和非侵袭性肿瘤细胞中主要定位于细胞膜，在细胞质中存在少量游离的β-catenin，在经历上皮-间质转化的细胞中，β-catenin多分布于细胞质或细胞核，β-catenin在细胞质中的定位反映了其与E-cadherin的分离[11]。大量研究显示，在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中，E-cadherin和β-catenin都有不同程度的分布异常和表达下调[12,13]。因此，不少研究希望通过促进或调节E-cadherin和βcatenin的表达抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭。

Slc7a11为谷胱甘肽的合成提供底物，主要参与调节氧化还原状态、铁死亡和细胞间信号传导。研究表明，Slc7a11在多种癌组织中高表达，特别是在对化疗和放疗等治疗有抵抗力的肿瘤中，被认为是一种重要的致癌蛋白，对肿瘤生长、侵袭、转移和不良预后产生多重影响[14,15]。细胞自噬属于Ⅱ型程序性细胞死亡，属于机体抵御不良环境的一种自我保护机制，对维持细胞稳定有着较好的作用。随着生物学研究的不断深入发现自噬在肿瘤发生、进展过程中起着关键作用，同时在肿瘤化疗药物细胞毒性也发挥作用。

本研究目前未能对Slc7a11促进乳腺癌细胞侵袭转移的分子机制进行深入探索。目前研究只能说明Slc7a11有促进细胞自噬作用，而自噬又参与了乳腺癌侵袭转移过程，但其具体的调控机制尚需进一步研究。基于此，Slc7a11是一个非常有价值的靶点，可通过对其的抑制进而调控细胞自噬，抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移，达到增强抗癌治疗效果。