UPLC 法测定维生素 B6 注射液的含量

高 奇，郭德才，王海燕，周 伟，吕宝兴，李玉琴*

（1. 山东第一医科大学（山东省医学科学院） 药学院，山东 泰安 271000；2. 泰安市食品药品检验检测研究院，山东 泰安 271016）

维生素 B6（结构式见图 1），又称盐酸吡哆素，是一种水溶性维生素，富含于鱼、蛋、花生等多种食物中，在肝脏中作为多种酶的辅酶参与氨基酸代谢等多种酶促反应，是人体必不可少的维生素之一[1-3]。临床上，维生素 B6注射液（Vitamin B6Injection）作为一种维生素补充剂，常采用皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式治疗体内维生素 B6缺乏，异烟肼中毒，妊娠、放射病及抗癌药所致的呕吐，脂溢性皮炎等疾病[4-6]。

Fig. 1 Structural formula of Vitamin B6图1 维生素 B6 的结构式

目前，维生素 B6的含量测定方法主要有荧光分光光度法（Fluorescence Spectrophotometry）[7-8]、紫外分光光度法（UV-Vis）[9-11]、高效液相色谱法（HPLC）[12-14]等。维生素 B6分子结构中吡啶环上的氮原子具有较强的碱性，且含有多个羟基，又使其具有较强的极性，导致其在 C18柱上的保留较弱和峰拖尾。为了改善维生素 B6在 C18柱上的保留和峰拖尾现象，2020 版《中国药典》（二部）采用反相离子对 HPLC 法测定维生素 B6注射液的含量[15]。离子对试剂能有效改善峰型及色谱峰的保留时间，但其与固定相结合易产生不可逆吸附，影响固定相活性位点，而且离子对试剂很难从色谱柱上冲洗干净，会大大缩短色谱柱的使用寿命。本研究拟建立超高效液相色谱法（UPLC）测定维生素 B6注射液的含量，并进行方法学验证，旨在为维生素 B6注射液的含量测定提供简单、快速而准确的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

超高效液相色谱仪（美国 Waters 公司）；KQ3200E 型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；SHIMUADZU AUW220D 型高精度电子天平（日本岛津）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 试剂与药品

维生素 B6对照品（质量分数 ＞ 98.0%，批号 K1929228，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；维生素 B6注射液（规格 2 mL : 0.1 g，批号 H37020720，山东新华制药股份有限公司）；乙腈（赛默飞世尔科技中国有限公司）；甲酸（上海麦克林生化科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm），0.1% 甲酸-乙腈（65 :35）为流动相，流速 0.1 mL·min-1，检测波长 291 nm，进样量 1 μL，室温测定。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液

精密称取维生素 B6对照品 5 mg，置 50 mL 量瓶中，以水定容至刻度，摇匀，即得 100 μg·mL-1的对照品储备液，4℃ 保存备用。后续实验中所有的对照品工作液临用前均用 0.22 μm 膜过滤，收集续滤液进样测定。

2.2.2 供试品溶液

取维生素 B6注射液 10 支，混合均匀，精密量取混合液适量（约相当于维生素 B60.125mg），置于 25 mL 量瓶中，以水定容至刻度，摇匀，4℃ 保存备用。供试品溶液临用前均用 0.22 μm膜过滤，收集续滤液进样测定。

2.3 专属性考察

分别精密量取空白溶剂和对照品工作液 20 μL，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图（见图 2）。由图 2 可知，在该色谱条件下溶剂峰对维生素 B6色谱峰无干扰，该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察

精密量取对照品储备液适量，用水稀释成浓度为 0.5、1、2.5、5、10、25 及 50 μg·mL-1的对照品工作液。按照“2.1”项下的色谱条件测定峰面积，以其浓度（c）对峰面积（A）进行线性回归，回归方程为A= 1.84 × 104c+ 5.56 × 103，R2= 0.999 2。结果表明，维生素 B6在 0.5～50 μg·mL-1范围内线性关系良好。

Fig. 2 UPLC chromatogram of blank solvent, vitamin B6 reference solution图2 空白溶剂、维生素B6对照品工作液的UPLC色谱图

2.5 精密度

配制低、中、高 3 种不同浓度（0.5、5、50 μg·mL-1）的维生素 B6对照品工作液，按照“2.1”项下的色谱条件，每个浓度重复测定 3 次，记录各次的峰面积，计算得 3 种不同浓度维生素 B6峰面积的 RSD 分别为0.005%、0.005%、0.002%；每个浓度重复测定 3 天，计算得 3 种不同浓度维生素 B6峰面积的 RSD 分别为 0.01%、0.005%、0.005%，结果表明本法精密度良好。

2.6 稳定性

按“2.2.2”方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h 按“2.1”项下的色谱条件测定维生素 B6的峰面积，计算得维生素 B6峰面积的 RSD 为 0.004%，结果表明供试品溶液 24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性

照“2.2.2”所述的方法，平行制备 6 份相同浓度的供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定峰面积。结果显示，6 份供试品溶液峰面积的 RSD 为 0.006%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率

精密量取 9 份 10 μg·mL-1的供试品溶液 2.5 mL，分别按照供试品溶液中维生素 B6含有量的 80%、100%、120% 精密加入 10 μg·mL-1对照品工作液适量，用水定容至 10 mL，摇匀。按“2.1”项下的色谱条件测定维生素 B6的峰面积，计算回收率（见表1）。结果表明，回收率在97.4%～99.5% 范围内，本法准确度较高。

2.9 检测限（LOD）及定量限（LOQ）

信噪比（S/N）3 : 1时，得方法的 LOD 值；S/N 为 10 : 1 时，得方法的 LOQ 值。将“2.2.1”项下的对照品储备液逐级稀释，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。进行验证，结果见图 3。结果表明，维生素 B6的 LOD 及 LOQ 分别为 0.04 μg·mL-1、0.12 μg·mL-1。

Table 1 The results of recovery rate of vitamin B6 in the test sample表1 供试品中维生素B6的加样回收率结果

Fig. 3 UPLC chromatogram of LOD (A) and LOQ (B) of vitamin B6 reference solution图3 维生素B6对照品工作液LOD（A）与 LOQ（B）的UPLC色谱图

2.10 样品的含量测定

按“2.2.2”项下的方法平行制备 3 份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积。代入回归方程计算注射液中维生素 B6的含量（见表 2）。由表 2可得含量测定结果符合 2020年版《中国药典》（二部）规定（维生素 B6注射液中维生素 B6的含量应为标示量的 93%～107.0%）。

Table 2 The results of the determination of vitamin B6 content in vitamin B6 injection表2 维生素B6注射液中维生素B6含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

精密量取线性关系考察项下 0.5 μg·mL-1的对照品工作液，在 240～400 nm 内对其进行扫描，其吸收光谱见图 4。结果显示，维生素 B6在 291 nm 处有最大吸收。

Fig. 4 Ultraviolet absorption spectrum of Vitamin B6图4 维生素 B6 紫外吸收光谱图

3.2 流动相的选择

因维生素 B6易溶于水，在 C18柱上保留弱。为了考察流动相对其保留行为的影响，首选了甲醇-水流动相系统，但甲醇作为氢键溶剂，粘度较大，维生素 B6在甲醇中的溶解性较差，洗脱效果差；而在乙腈-水体系中，维生素 B6色谱峰会出现拖尾、峰型扁平等现象，且调节流动相比例峰形改善效果不明显；进一步考察发现在乙腈-水体系中加入甲酸能有效改善峰型及拖尾现象，有助于其保留，故本实验选择 0.1% 甲酸-乙腈（65 : 35）为流动相。

3.3 柱温的选择

对于化合物的保留，温度降低，保留增强；温度升高，保留变弱。本实验考察了不同柱温（室温 32℃、35℃）对维生素 B6色谱峰的影响。结果显示，随着柱温的升高，维生素 B6色谱峰会出现弱保留的现象。考虑其原因为维生素 B6水溶性较好，温度升高对其保留不利。因此，本实验在室温下进行。

3.4 流速的选择

本实验考察了不同流速（0.1、0.2 mL·min-1）对维生素 B6保留行为和峰形的影响。结果显示，随着流速提高，维生素 B6色谱峰出峰快、基线不稳，且易和溶剂峰重叠。为保证溶剂峰和维生素 B6峰达到基线分离，本实验选用的流速为 0.1 mL·min-1。

4 结论

本实验建立了测定维生素 B6注射液含量的 UPLC 法。方法学考察结果显示，该方法专属性强、准确度高，便于操作。与 HPLC 法相比，UPLC 法缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量，降低了分析成本。含量测定结果符合 2020 年版《中国药典》（二部）规定，本法可用于维生素B6注射液的含量测定。