高效液相色谱法测定甲钴胺片的有关物质

郑发鲁 ，顾 林，张志才，邹梅娟

（1. 沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016；2. 扬子江药业集团 南京海陵药业有限公司，江苏 南京 210049）

甲钴胺是一种内源性的辅酶 B12，参与一碳单位循环，在由同型半胱氨酸合成蛋氨酸的转甲基反应过程中起重要作用，具有营养神经，调节神经功能的功效[1]。因此，目前临床上广泛用于一些周围神经病变，如末梢神经炎、面神经炎、面瘫、三叉神经痛或者糖尿病周围神经病变等疾病的治疗[2-5]。原研为日本卫材研发生产的糖衣片，2003 年获得中国国家食品药品监督管理局批准正式上市。制剂中有关物质检测是其质量研究的重要方面，《日本药典》17 版中甲钴胺片质量标准中无有关物质检查项，《中国药典》2020 年版二部甲钴胺片质量标准中未对其降解杂质羟钴胺、氰钴胺进行控制。现参考国内外文献[6-7]，建立高效液相色谱（HPLC）法测定甲钴胺片中有关物质方法，以促进该制剂质量的提高。

1 仪器与试药

Agilent1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦）；XSE205 电子分析天平（瑞士梅特勒）；水为超纯水；乙腈为 Tedia 色谱纯；己烷磺酸钠为 Fisher Chemical 色谱纯；其他试剂均为分析纯。对照品甲钴胺对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100692-201403，含量为 94.4%）；氰钴胺对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100248-201504，含量为 89.7%）；羟钴胺对照品（TRC，批号：11-XAL-96-1，含量为96.49%）；自制甲钴胺片（批号：16112701、16121402、16121403）；原研甲钴胺片（卫材（中国），批号：5YA28P）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱条件如下：色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18（4.6 × 250 mm, 4 μm）；以含己烷磺酸钠0.47% 的 0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（用稀磷酸调节 pH 至 3.5）为流动相 A，乙腈为流动相B；按表1进行梯度洗脱，后运行时间设置为 10 min；柱温为 40 ℃；进样器温度为 4 ℃；流速为 1.0 mL·min-1，检测波长为 266 nm，进样量 40 μL。

Table 1 Gradient elution procedure表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的配制

系统适用性溶液：称取甲钴胺片25 片，置于 50 mL 量瓶，分别加入适量氰钴胺、羟钴胺杂质，加稀释剂超声溶解，冷却至室温，加稀释剂稀释制成每 1 mL 中含甲钴胺约 0.25 mg、氰钴胺 2.5 μg、羟钴胺 2.5 μg 溶液，即得。

稀释剂：pH12 磷酸-氢氧化钾溶液（0.1 mol·L-1的氢氧化钾溶液，用稀磷酸调节 pH 至 12，即得）。

空白溶液：稀释剂过 0.45 μm × 25 mm 水相滤膜，即得。

辅料空白溶液：避光操作，取甲钴胺片剂辅料约 375 mg 于 10 mL 棕色量瓶中，加稀释剂超声溶解并定容至刻度，将所得溶液滤过，即得。

供试品溶液：取本品 25 片，置 50 mL 量瓶，加稀释剂超声溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

1% 对照溶液：取约 12.5 mg 甲钴胺对照品，置于 50 mL 量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液母液。取 1 mL 该溶液置于 100 mL 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

分别取空白溶液、辅料空白溶液、系统适应性溶液、供试品溶液 40 μL，进样，记录色谱图。结果空白稀释剂和辅料不干扰主成分检测；系统适应性溶液、供试品溶液中主成分与相邻杂质分离度均大于 1.5。

2.3.2 破坏性试验

采用强制降解试验进行专属性验证。

（1）未破坏溶液的制备：避光操作，取甲钴胺片剂 5 片于 10 mL 棕色量瓶中，加稀释剂超声崩解并定容至刻度，用 0.45 μm × 25 mm 滤膜滤过，即得。

（2）强光破坏溶液的制备：取甲钴胺片剂 5 片于 10 mL 无色量瓶中，加适量稀释剂超声崩解，置于 (4500 ± 500) lx 光照条件下照射 60 s，加稀释剂稀释至刻度，用 0.45 μm × 25 mm 滤膜滤过，即得。

（3）高温破坏溶液的制备：避光操作，取甲钴胺片剂 5 片于 10 mL 棕色量瓶中，加适量稀释剂超声崩解，置于 80℃ 烘箱中 1 h，冷却至室温，加稀释剂稀释至刻度，用 0.45 μm × 25 mm滤膜滤过，即得。

（4）紫外破坏溶液的制备：取甲钴胺片剂 5 片于 10 mL 无色量瓶中，加适量稀释剂超声崩解，置于紫外光条件下照射 5 min，加稀释剂稀释至刻度，用 0.45 μm × 25 mm 滤膜滤过，即得。

（5）酸破坏溶液的制备：量取 0.1 mol·L-1盐酸溶液 1 mL，加入 0.1 mol·L-1NaOH 溶液 1 mL调 pH 至中性，稀释剂稀释定容至刻度，作为酸碱空白溶液；避光操作，取甲钴胺片剂 5 片于10 mL棕色量瓶中，加稀释剂适量超声溶解，加 0.1 mol·L-1盐酸溶液 1 mL，室温混匀放置 1 h 后，用0.1 mol·L-1NaOH 调溶液 pH 至中性，加稀释剂超声崩解并定容至刻度，用 0.45 μm × 25 mm滤膜滤过，即得。

（6）碱破坏溶液的制备：避光操作，取甲钴胺片剂 5 片于 10 mL 棕色量瓶中，用稀释剂适量超声溶解，加 0.1 mol·L-1NaOH 溶液 1 ml，室温混匀放置 1 h 后，用 0.1 mol·L-1盐酸调溶液pH 至中性，加稀释剂定容至刻度，用 0.45 μm × 25 mm 滤膜滤过，即得。

（7）氧破坏溶液的制备：避光操作，取甲钴胺片剂 5 片于 10 mL 棕色量瓶中，加稀释剂适量超声溶解，加 30% 的双氧稀释剂 1 mL 混匀放置 1 h 后，加稀释剂定容至刻度，用 0.45 μm ×25 mm 滤膜滤过，即得。

分别取上述供试品溶液和空白辅料溶液 40 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图（见图 1）。

根据试验结果可知，各条件空白及空白辅料均不影响样品杂质检出，且主峰与临近杂质峰的分离度均大于 1.5。样品处于液体状态下，在高温、强光、紫外光及氧化剂存在下出现明显的降解趋势，总杂含量明显增加，且氧化破坏和高温液体破坏的杂质个数明显增加。故在后期的药品贮存中，应注意遮光、避免较高的温度及密闭保存。在各破坏条件下，物料回收率均在 90%～110%之间，物料平衡，符合规定。

2.3.3 检测限和定量限

精密称取甲钴胺对照品、羟钴胺对照品和氰钴胺对照品，用稀释剂溶解并逐步稀释至系列浓度。依法进样，将信噪比 S/N 约为 3 时的浓度定为检测限，将信噪比 S/N 约为 10 时的浓度定为定量限。并将定量限溶液连续进样 6 针，考察精密度。结果甲钴胺的定量限及检测限分别为2.88 ng、0.43 ng；氰钴胺的定量限检测限 9.39 ng、2.82 ng；羟钴胺的定量限检测限为 9.78 ng、3.03 ng；甲钴胺定量限溶液连续进样 6 针保留时间和峰面积 RSD 分别为 0.1%、6.3%；氰钴胺定量限溶液连续进样 6 针保留时间和峰面积 RSD 分别为 0.2%、8.8%；羟钴胺定量限溶液连续进样 6 针保留时间和峰面积 RSD 分别为 0.1%、7.0%；符合保留时间 RSD 小于 2.0%，峰面积RSD 小于 10.0% 的规定。

2.3.4 杂质线性试验及校正因子测定

分别称取甲钴胺对照品及各已知杂质对照品适量，分别用稀释剂溶解并稀释制成系列质量浓度溶液，分别进样 40 μL，以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程与线性范围（详见表2）。可见，甲钴胺、氰钴胺、羟钴胺的线性关系均较好，r≥ 0.999 8。

Fig. 1 High-performance liquid chromatography of destructive test图1 破坏试验高效液相色谱图

Table 2 Test results of the linear relation表2 线性关系试验结果

由两名试验员 1 和试验员 2 的分别按上法测定三份标准曲线数据，各杂质的校正因子采用两名试验人员的杂质相对校正因子的平均值计算。结果氰钴胺和羟钴胺的校正因子均为 1.6。

2.3.5 重复性试验

取样品（批号为 16112701）适量，按“2.2 项”下方法分别制备 6 份供试品溶液和 1% 对照品溶液，依法测定有关物质含量。结果 6 份加杂质的供试品溶液中，氰钴胺的 A/C 的 RSD 为1.0%，羟钴胺的 A/C 的 RSD 为 1.9%，均小于 10.0%，且杂质个数基本一致，重复性良好。由两名分析人员使用不同的仪器和不同的色谱柱在不同的日期进行，考察中间精密度。结果羟钴胺12 份数据的 A/C 平均值为 36.09，RSD 为 3.1%；氰钴胺的 12 份 A/C 数据的平均值为 34.56，RSD 为 1.4%，均符合小于 10.0% 的要求。

2.3.6 准确度试验

杂质对照品贮备液：精密称取氰钴胺、羟钴胺对照品适量，分别置于棕色量瓶中，加适量水超声溶解，加水稀释定容至刻度，制成每毫升约含氰钴胺与羟钴胺分别为 125 μg 的杂质贮备液，摇匀，即得。

杂质对照品溶液：精密量取各杂质对照品贮备液 1 mL，置 50 mL 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，0.45 μm × 25 mm 水相滤膜滤过，摇匀，即得。

Table 3 Test results of the accuracy of impurity hydroxocobalamin表3 杂质羟钴胺准确度试验结果（%, n = 9）

Table 4 Test results of the accuracy of impurity cyanocobalamin表4 杂质氰钴胺准确度试验结果（%, n = 9）

将甲钴胺片各取 25 片，分别置于 50 mL 棕色量瓶，加适量稀释剂超声溶解，分别加入杂质对照品贮备液 0.5、1、1.5 mL（相当于加入各杂质标准限度的 50%、100%、150% 浓度水平），用稀释剂稀释至刻度，摇匀，0.45 μm × 25 mm 水相滤膜滤过，摇匀，即得。按“2.1项”下色谱条件测定有关物质，每个浓度稀释剂平同法配制 3 份（结果见表3、表4）。各已知杂质不同质量浓度的平均回收率均在 95.56%～108.04%之间，RSD 均小于2.4%（n= 9）。

2.3.8 耐用性试验

在“2.1项”下色谱条件基础上，分别对 pH、流速、柱温、检测波长进行耐用性考察。由于相邻杂质与主峰最近，已知杂质与主峰及各杂质之间分离均较好，故耐用性试验中主要考察考察分离度和杂质检出量。结果流速 (1.0 ± 0.2) mL·min-1、柱温 40℃ ± 5℃、波长 (266 ± 5) nm、流动相 pH (3.5 ± 0.2)，各条件下空白及辅料空白对样品检测无干扰，检出的特定杂质氰钴胺、羟钴胺含量 RSD 均小于 10.0%。根据耐用性结果，柱温变化 40℃ ± 5℃，杂质的测量的准确性影响较大，故需注意控制柱温。综上所述，甲钴胺片有关物质方法耐用性良好。

3 讨论

《日本药典》17 版甲钴胺片质量标准中无有关物质检查项。通过对现有各个标准中有关物质方法流动相体系进行比较，发现甲钴胺注射液进口注册标准和《日本药典》17 版中甲钴胺质量标准流动相体系较优，溶剂峰不干扰检测，峰型良好，杂质与杂质之间、杂质与主峰之间分离度符合要求。甲钴胺的最大吸收波长为 267 nm，氰钴胺及羟钴胺杂质在此波段均有紫外吸收，综合日本药典标准中的吸收波长，选择 266 nm作为分析方法的检测波长。使用 Agilent Poroshell ECC18 (4.6 × 250 mm, 4 μm) 色谱柱，含 0.47% 己烷磺酸钠的 0.02 mol·mL-1磷酸二氢钾溶液（用稀磷酸调节 pH 至 3.5）-乙腈为流动性的梯度洗脱，主峰与杂质的分离度都大于 2.0，均达到基线分离，主峰理论塔板数和检测出的杂质个数优于现有标准。

方法学验证过程中，经准确度研究筛选发现，pH12.0 的氢氧化钾-磷酸缓冲盐为溶剂较水作为溶剂，各杂质有更优的回收率。且在 pH12.0 的氢氧化钾-磷酸缓冲盐的溶液中，甲钴胺稳定性与水中类似，但比水时杂质检出量高，杂质检出个数多；为了样品得以充分溶解，同时节约操作时间，故选择 pH12.0 的溶剂（0.1 mol·L-1氢氧化钾溶液，用磷酸调节 pH 为 12.0）作为稀释液，超声时间为 10 min，超声时水温不得超过 20℃。

本品每日最大摄入剂量为 1.5 mg，ICH《Q3b 新制剂的杂质要求》相关杂质的界定阈值为1.0%。参照《日本药典》17 版、《中国药典》2020 年版二部中甲钴胺片标准及《化学药物杂质研究的技术指导原则》杂质限度的相关要求，结合产品的质量和稳定性数据制定甲钴胺片有关物质限度：羟钴胺 ≤ 1.0%、氰钴胺 ≤ 1.0%、单杂 ≤ 1.0%、总杂 ≤ 3.0%。本试验测定了 3 批自制样品和 1 批参比制剂的有关物质，自制样品的氰钴胺均未检出，羟钴胺均为 0.1%，其他杂质均为 0.2%，总杂不大于 1.0%，符合企业标准，并且低于参比制剂测定结果。

综上所述，本试验确定的色谱方法经验证，其专属性较强，能完全有效地测定样品中的有关物质及其降解杂质，可用于控制自制甲钴胺片的质量。