ARMS-PCR技术在玫瑰果鉴别中的应用

2023-02-08邵婕杨正修邹强陆峥飞李凡

食品工业 2023年1期

邵婕，杨正修，邹强，陆峥飞，李凡*

1. 康宝莱蕾硕（湖南）天然产物有限公司（长沙 410100）；2. 康宝莱全球测试中心HP1实验室（托伦斯 90502）

玫瑰果（Rosa canina）在世界上有着悠久的药食两用历史。玫瑰果中多酚、黄酮、维生素C等活性物质含量丰富，具有抗氧化、抗癌、抗辐射和抑菌等多种药理作用[1]*。但玫瑰果原料品种繁多，蔷薇属果实的化学成分、抗氧化能力和个体酚类物质含量存在显著差异[2]*。刺玫果（Rosa duvarica）和玫瑰果属于同一植物属，两者不仅在外观上非常相似，活性物质也非常相似，主要包括黄酮、多糖、三萜等[3]*。由于化学成分的相似性，常见的化学鉴定方法难以对二者进行区分，使得玫瑰果掺假特别是混合掺假的检测具有挑战性。扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应（amplification refractory mutation system-PCR，ARMSPCR）技术[4]*常用于遗传疾病[5]*、基因分型[6]*和微生物学[7]*等许多快速检测研究领域，在植物鉴定和分析化学中的应用鲜有报道。

试验通过对玫瑰果和刺玫果基因组序列的比较分析，建立一种基于特征SNP位点的ARMS-PCR方法，可用于鉴定玫瑰果和刺玫果。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

化学标准品Isoquercetin（ChromaDex ASB-00009505-025）。

植物对照药材（Botanical Reference Material，BRM）：玫瑰果果实BRM（Lot 00030792-473，ASB-00030792-005，ChromaDex. Inc）；刺玫果果实BRM（Lot 121255-201203，121255，购自National Institute of Food and Drug Control，NIFDC）。

植物材料：从中国原料市场采购11份玫瑰果用于验证。

Automatic TLC Sampler 4（Chromacim，Moirans，法国）；硅胶板（60 F254，20×10 cm，Merck，德国）；CAMAG TLC可视化仪（Chromacim，Moirans，法国）；DNeasy mericon Food Kit；Qubit 3.0荧光计（Thermofisher，广州，中国）；C1000 Touch（BIORAD，上海，中国）；Integrated DNA Technologies（Thermofisher，广州，中国）；AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix（Thermo Fisher，立陶宛）。

1.2 高效薄层色谱（high-performance thin layer chromatography，HPTLC）

样品处理：称取500 mg玫瑰果或刺玫果果实BRM到15 mL试管中，加入10 mL甲醇，涡旋30 s。超声处理15 min。将一部分样品通过0.45 μm滤膜过滤到HPLC进样瓶中。

使用Automatic TLC Sampler 4将样品喷涂到预制硅胶板上，Isoquercetin作为化学标准品喷涂到预制硅胶板上。用流动相（乙酸乙酯/乙酸/甲酸/超纯水100/11/11/26）展开，使用10%硫酸进行显色。用CAMAG TLC可视化仪和Vision cats软件拍摄照片。

1.3 DNA提取

DNA提取过程均根据制造商的说明使用DNeasy mericon Food Kit进行。过程：将50～100 mg玫瑰果或刺玫果果实BRM，1 mL Food Lysis Buffer和2.5 μL Proteinase K加入离心管中，在60 ℃下孵育30 min，并以2 500×g离心5 min；取700 μL上清液于新的离心管中，加入500 μL氯仿，涡旋15 s，并将混合物以14 000×g离心15 min；将350 μL上清液转移到新的离心管中，加入350 μL PB Buffer，将混合液转移到吸附柱中，以17 000×g离心1 min；弃去收集管中溶液；向吸附柱中加入500 μL AW2 Buffer，并以17 000×g离心1 min；将收集管中的溶液再次倒出，并将吸附柱以17 000×g离心2 min；将吸附柱放入新的离心管中，加入100 μL TE缓冲液，并将其以17 900×g离心2 min；使用Qubit 3.0荧光计进行定量。

1.4 DNA Barcode序列采集及植物鉴定

使用2对引物对玫瑰果和刺玫果gDNA（genomic DNA）进行扩增，扩增体系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每种引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上进行PCR扩增，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s（58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃终末延伸3 min。RbcL-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATGTCACCACAAACAGAAAC-3’；RbcL-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGTAAAA TCAAGKCCACCRCG-3’；ITS2-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATCCGATACTTGGTGTGAAT-3’；ITS2-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。获得RbcL与ITS2基因片段，通过sanger测序获取序列信息。引物由Integrated DNA Technologies（Thermofisher，广州，中国）合成。

双盲试验：将11份玫瑰果市场样品与14份刺玫果果实BRM由试验人员1随机编排顺序并编号，通过DNA barcode技术对25个样品进行鉴定。提取25个样品gDNA后，通过RbcL和ITS2这2对引物对gDNA进行PCR扩增，扩增体系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每种引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上进行PCR扩增，反应条件为95 ℃预变性5分钟，95 ℃变性30 s（58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃终末延伸3 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果后进行Sanger测序，确认样品种属信息。试验人员2通过ARMS-PCR对25个样品进行鉴别。

1.6 ARMS-PCR

使用AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix对玫瑰果与刺玫果的gDNA进行扩增，扩增体系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每种引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上进行PCR扩增，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s（58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃终末延伸3 min。原始DNA洗脱用于PCR反应，无需调整浓度。每次运行都包括阳性对照和阴性对照，PCR产品在带有DNA染料的2%琼脂糖凝胶中可视化。各基因及其引物的扩增引物序列详见表1。引物由Integrated DNA Technologies合成。

表1 ARMS-PCR引物信息表

1.7 生物信息学分析

从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载所有序列，从NCBI下载的所有序列在MEGA X中使用ClustalW默认设置进行比对，引物设计使用Primer 3.0 plus（https://www.primer3plus.com/）。DNA条形码序列使用CodonCode Aligner和APE软件进行分析。Sanger测序结果在NCBI上进行比对。

1.8 统计学分析

双盲试验所获得的试验数据通过POI（probability of identification）进行分析[8]*。

2 结果与分析

2.1 HPTLC鉴别玫瑰果和刺玫果

通过HPTLC方法检测玫瑰果和刺玫果，玫瑰果果实含有Isoquercetin[9]*，以Isoquercetin作为化学标准品，其位置和可见度如图1所示。Rf值为0.59。玫瑰果和刺玫果HPTLC指纹图谱非常相似，两者之间的主要区别是检测到的条带的相对密度。因此，HPTLC难以区分玫瑰果和刺玫果。

图1 玫瑰果和刺玫果HPTLC指纹图谱

2.2 玫瑰果与刺玫果DNA barcode序列采集及引物设计

由于植物中ITS和rbcL区域的选择压力小、变异大，因此选择该区域进行ARMS-PCR分析可更有效地区分遗传关系密切的物种。通过DNA barcode方法获取玫瑰果和刺玫果的ITS2和RbcL基因片段，Sanger测序得到序列信息（表2）。

表2 玫瑰果及刺玫果ITS2和RbcL序列信息

为验证ARMS-PCR区分玫瑰果和刺玫果的可行性，根据3个不同的SNP位点分别设计P1、P2和P3这3种方案。P1方案的设计基于RbcL区域序列，而P2和P3方案的设计基于ITS2区域序列（图2）。

图2 候选ARMS-PCR引物在RbcL（P1）和ITS2区域（P2和P3）中的位置

以P2方案为例，分析ARMS-PCR的工作原理（图3）。基于SNP位置设计4条引物（表1）Outer F，Outer R，Inner F和Inner R，为玫瑰果和刺玫果提供不同长度的PCR片段。Outer F和Outer R配对从基因组DNA中扩增出1个182 bp的片段作为内参，Inner F和Inner R分别作为玫瑰果和刺玫果的特异性引物。玫瑰果DNA存在时，Inner F与玫瑰果的DNA模板之间形成完美匹配，Inner F与Outer R配对扩增出1段135 bp的片段。只有当Inner R与刺玫果的DNA模板之间形成完美匹配时，Inner R才能与Outer F配对扩增出1段86 bp片段。DNA模板中只存在玫瑰果DNA时，可以得到1条182 bp的内参条带和1条135 bp的特异性条带。DNA模板中只存在刺玫果DNA时，可以得到1条182 bp的内参条带和1条86 bp的特异性条带。当DNA模板中同时存在玫瑰果和刺玫果DNA时，可以得到1条182 bp的内参条带，1条135 bp的特异性条带和1条86 bp的特异性条带。

图3 ARMS-PCR的P2设计示意图

接表2

2.3 ARMS-PCR条件优化

为从P1、P2和P3中筛选最佳的试验方案，使用玫瑰果和刺玫果果实BRM，通过DNA提取和PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，P1方案针对玫瑰果和刺玫果进行扩增，其扩增产物一致，均为1条100 bp左右的条带，P3方案针对玫瑰果和刺玫果均得到两条200 bp左右的条带，P1和P3方案均无法区分玫瑰果和刺玫果。P2方案针对玫瑰果可得到1条182 bp的内参条带和1条135 bp的特异性条带，针对刺玫果可得到1条182 bp的内参条带和1条86 bp的特异性条带，可明显区分玫瑰果和刺玫果。结果表明P2方案优于P1和P3方案，可以达到预期结果（图4）。

图4 3种设计的ARMS-PCR的验证结果

由于设计的4条引物的退火温度不同，设计梯度PCR试验。从图5（A）可以看出，最佳退火温度为58℃。PCR的循环数决定扩增产物的产量，循环数太多会易出现非特异条带。为避免非特异性条带干扰，分别测试25 cycles和28 cycles的扩增效率，从图5（B）可以看出，28 cycles和25 cycles均无非特异性条带，但28 cycles电泳信号强度优于25 cycles，表明28 cycles优于25 cycles。

图5 ARMS-PCR条件优化

2.4 ARMS-PCR验证

为验证ARMS-PCR玫瑰果鉴定的准确性，通过双盲试验测试玫瑰果市场样品和刺玫果果实BRM，25个样品经DNA barcode技术进行鉴定。ARMS-PCR结果表明（图6），S-1，S-3，S-6，S-8，S-9，S-10，S-12，S-15，S-16，S-17，S-21，S-22，S-24，S-25这14个样品被鉴定为刺玫果，S-2，S-4，S-5，S-7，S-11，S-13，S-14，S-18，S-19，S-20，S-23这11个样品被鉴定为玫瑰果。该结果与DNA barcode方法结果完全一致。基于POI统计分析，该测定对于鉴别玫瑰果和刺玫果果实原材料具有大于0.9（95%CI）的识别概率。

图6 ARMS-PCR验证市场25批样品

2.5 玫瑰果中刺玫果的最低检测限确认

为进一步探索ARMS-PCR的检出限，将玫瑰果和刺玫果BRM粉末按质量比10/90，20/80，30/70，40/60，50/50，60/40，70/30，80/20和90/10进行混合。从这些混合材料中提取DNA用于扩增。结果显示（图7A），100%玫瑰果电泳结果仅有1条182 bp的内参条带和1条135 bp的特异性条带，添加10%～90%刺玫果后，电泳结果显示多1条86 bp的刺玫果特异性条带，且随着刺玫果添加量的升高，135 bp的玫瑰果特异性条带强度降低。为确认刺玫果的最低检测限，对10%的刺玫果进行重复验证，结果如图7（B）所示。结果显示，10次重复结果一致，均可检出86 bp的刺玫果特异性条带。综上所述，该方法对玫瑰果中刺玫果的最低检测限为10%。