复配生物防腐剂对面包防腐效果

王雅妮，孙畅，赵汉青，魏孝宇，郑朝显，袁怀波*

1. 合肥工业大学食品与生物工程学院（合肥 230601）；

2. 安庆师范大学资源环境学院（安庆 246133）；3. 安徽麦吉食品有限公司（阜阳 236000）

面包生产工艺流程包括面团调制、发酵、搓圆、整型、二次发酵、烘烤[1]*。面包的水分活度高，pH呈酸性，碳水和蛋白含量较高，在贮存过程中容易产生微生物，受霉菌污染[2-4]*。向面包等烘焙制品中添加防腐剂是常见的面包保鲜、保质手段[5]*。生物防腐剂相比化学防腐剂具有多重优势：毒性低，抑菌作用明显，使用量更少和热稳定性好[6]*。生物防腐剂主要通过对动植物分泌的抑菌物质进行提纯和加工制备得到[7]*。试验采用乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸等微生物防腐剂，开展复配生物防腐剂在面包保鲜防腐中应用效果研究，为面包产业的开发应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂

菌种：青霉菌（Penicilliumsp.），子囊菌亚门、青霉属青霉菌（合肥工业大学食品与生物工程学院）。

纳他霉素、乳酸链球菌素、聚赖氨酸（河南万邦实业有限公司）；NaCl（AR级，国药集团化学试剂有限公司）；滤膜（0.22 μm）；平板计数琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖水（PDB）：杭州微生物试剂有限公司；3.0 g/kg纳他霉素盐酸溶液（0.30 g纳他霉素用0.02 mol/L HCl溶解，24 h内使用）；2.5 g/kg乳酸链球菌溶液（24 h内使用）；1.5 g/kgε-聚赖氨酸溶液（0.22 μm滤膜过滤，24 h内使用）；青霉菌孢子悬液（CFU/mL，于-4℃备用）。

面包制作原料：高筋面粉、白砂糖、食用盐、酵母、鸡蛋、牛奶、黄油。

1.2 仪器与设备

1.3 试验方法

1.3.1 面包制作工艺流程

原料搅拌→和面→发酵→分块→搓圆→整型→二次发酵→焙烤→冷却

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 单一防腐剂对青霉菌的抑制效果

以制备好的菌悬液作为供试样品，参照GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》等确定防腐剂纳他霉素、乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸的最大添加量，分别为0.30，0.25和0.15 g/kg。在PDB培养基中添加不同浓度防腐剂（各防腐剂添加量最大值的100%，85%，70%，55%，40%，25%，10%和0），将防腐剂稀释2倍，按照此防腐剂添加浓度依次加入无菌96微孔板中，每个微孔中分别添加200 μL不同浓度防腐剂，向每孔中加入5 μL青霉菌菌悬液，在28 ℃培养箱中培养48 h后，使用酶标仪测定A580nm，分别测定单一防腐剂对青霉菌的抑制效果。每组试验3次平行，以吸光度较小值为标准选择优化添加浓度范围。

1.3.2.2 响应面法优化复配防腐剂配比

根据单一防腐剂的抑菌效果试验结果，以A580nm为响应值（R），设计三因素三水平Box-Bohnken试验优化复配防腐剂配比，每种防腐剂设3组平行试验。对最优配比进行验证试验（平行3次）。

有报道,因子宫异常造成的习惯性流产占1.8%~37.6%,是晚期流产的常见原因。子宫异常包括先天畸形、子宫肌瘤、宫腔粘连、内膜息肉等。对复发性流产妇女进行输卵管子宫碘油造影或宫腔镜检查发现,Mtillerian管畸形占8%~10%,其引起习惯性流产的原因可能为:胚胎和胎盘的血管化不充分,宫腔体积减小或宫颈功能不全[4-6]。经验丰富的B超医生对子宫畸形的诊断有较高的敏感性,三维超声的诊断价值似乎很有前途,因为它不仅可以诊断子宫畸形,还可以对畸形进行分类,甚至可取代诊断性的宫腔镜和腹腔镜检查。

1.3.2.3 复配防腐剂抑菌效果验证

按照高筋面粉400 g、酵母5 g、白糖60 g、盐2 g、牛奶175 g和鸡蛋100 g的原料配方制作成品面包，配制最佳配比浓度的复配防腐剂水溶液。在试验组面包表面均匀地喷涂复配防腐剂溶液，对照组喷涂相应量的无菌超纯水。2组面包均在室温放置3 h后进行取样检测。参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》和GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》分别测定菌落总数和霉菌总数。取25 g冷却30 min后的面包加入225 mL无菌生理盐水中，均质器均质并混合均匀，即为10-1*的样品稀释液，依次梯度稀释。从若干浓度范围中选择3个合适的稀释浓度，通过平板倾注的方法，取1 mL稀释液加到PCA和PDA培养基，充分混匀。这3个稀释浓度在2个培养基中分别做两个平行，测定菌落总数的培养皿于37 ℃培养48 h，霉菌计数则在28 ℃培养5 d，观察记录结果。

2 结果与分析

2.1 单一防腐剂对青霉菌的抑制效果

根据图1（A）可知，吸光度随着乳酸链球菌素添加量增加呈现先下降后缓慢上升趋势，乳酸链球菌素添加量0.1 g/kg时有最小吸光度A580nm，即意味此防腐剂在该浓度下的抑菌效果最佳。根据图1（B）可知，吸光度随着纳他霉素添加量增加呈现先下降后缓慢上升趋势，纳他霉素添加量0.075 g/kg时，吸光度最低，此防腐剂在该浓度下抑菌效果最好。根据图1（C）可知，吸光度随着ε-聚赖氨酸添加量的增加呈现先下降后缓慢上升趋势，ε-聚赖氨酸添加量0.06 kg时有最小的吸光度A580nm，表明此防腐剂在该浓度下的抑菌效果明显。结果表明，吸光度最小值对应的防腐剂浓度对青霉菌的抑制效果最佳，选择相邻浓度为优化区间，因此乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸的优化浓度范围分别为0.062 5～0.137 5，0.03～0.12和0.037 5～0.082 5 g/kg，用于防腐剂最佳配方的研究。

图1 单一防腐剂对青霉菌的抑制效果

2.2 响应面法优化

2.2.1 试验因素及水平

根据防腐剂的单因素抑菌试验的优化浓度范围从而设置因素水平表，见表1。

表1 响应面分析法的因素与水平表 单位：g/kg

2.2.2 响应面设计及试验结果分析

Box-Behnken设计与试验结果如表2所示。通过Design Expert 13软件对试验数据进行分析，得回归方程模型：R=0.408 4+0.018 4A+0.031 4B-0.006 7C+0.023 3AB-0.016 5AC+0.064BC+0.026 4A2*+0.061 9B2*+0.101 7C2*。

表2 Box-Behnken设计与试验结果

对数据进行二次多元回归拟合分析，得到回归方程模型的方差分析与系数估计值，如表3所示。响应面模型的相关系数R2*=0.910 0，模型回归效果具有显著性（P＜0.01），失拟项没有显著性（P＞0.05），说明该回归方程模拟的三因素三水平分析可靠；模型的相关系数R2*=0.910 0，矫正决定系数Radj2*=0.794 2，说明选择的自变量合适，模型能较好描述试验结果，可进行进一步分析。

从表3可以看出，B和BC的P值小于0.05，说明纳他霉素及纳他霉素和乳酸链球菌素的交互作用对吸光度的影响显著。防腐剂对吸光度A580nm的影响大小为纳他霉素（B）＞ε-聚赖氨酸（A）＞乳酸链球菌素（C）。

表3 回归方程的方差分析

响应面图反映各因素及其交互作用对吸光度A580nm的影响。由图2可知，响应面整体呈现中心凹陷的形状，图2（C）等高线呈椭圆形，可以看出BC因素具有显著性。其中，图2（C）的响应面坡度变化最明显，且等高线图相比其他更接近椭圆形。纳他霉素和乳酸链球菌素两者之间的交互作用对吸光度的影响很大，即抑菌效果的影响最大。

图2 防腐剂之间的交互作用

2.2.3 复配防腐剂配比的确定

通过Design Expert 13的软件处理数据，得到复配防腐剂最佳的各组分配比，此时的吸光度最小，为0.402，生物防腐剂各配比为ε-聚赖氨酸0.056 g/kg、纳他霉素0.063 g/kg、乳酸链球菌素0.104 g/kg，这种配方抑菌效果最好。各类防腐剂各自用量占其最大使用量比例之和不应超过1，防腐剂比例之和为0.999 3，使用量符合GB 2760—2014规定。

按照该组合进行平行3次的验证试验得到吸光度A580nm，其平均值为0.421，与理论值的相对误差为4.73%，无显著差异，说明试验结果与模型拟合良好，该模型可信。

2.2.4 复配防腐剂的抑菌效果验证

根据面包的国家标准规定，面包安全有许多的鉴定指标，试验中测定的是面包的微生物指标以判断防腐效果。分别经过48 h和5 d，测定菌落总数和霉菌数。由表4可知，试验组和对照组的菌落总数符合国家标准，远小于国标规定的可接受水平限量值（104*CFU/g），但对照组的菌落总数远大于试验组。在霉菌数方面，试验组未检出霉菌，而对照组霉菌数量超出国标规定的限量（150 CFU/g）。

表4 面包防腐效果的微生物指标评价 单位：CFU/g

3 结论

以ε-聚赖氨酸、纳他霉素和乳酸链球菌素为主要原料，通过单因素体外抑菌试验和响应面试验，确定面包的最佳复配防腐剂配方，并对优化效果进行验证。通过试验发现，在ε-聚赖氨酸浓度0.056 g/kg、纳他霉素浓度0.063 g/kg、乳酸链球菌素浓度0.104 g/kg的条件下，复配防腐剂的抑菌效果最好。试验结果对开发生物防腐面包提供理论支持，随着食品科学和微生物技术的不断发展，未来生物防腐剂将有更广阔的发展前景。