慢性乙型肝炎临床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平及临床特点

谭 宁， 刘建湘， 亢 倩， 潘家莉， 韩一凡， 陈宏宇， 徐小元

北京大学第一医院 消化内科， 北京 100034

目前慢性乙型肝炎(CHB)患者的抗病毒治疗药物主要是干扰素α和核苷(酸)类似物(NUC)[1-2]。一部分CHB患者适合干扰素治疗，这些患者中不到10%可以发生持续的HBsAg转阴[3]。由于聚乙二醇干扰素α的不良反应和禁忌证，还有一部分CHB患者接受长期的NUC抗病毒治疗，只有很少的患者可以在长期抗病毒治疗过程中达到HBsAg转阴，HBeAg阳性初治患者在5～8年抗病毒治疗后HBsAg转阴率为10%～12%，而HBeAg阴性初治患者只有<1%～2%的患者发生HBsAg转阴[4]。CHB患者停止治疗后仍保持HBsAg阴性，抗-HBs阳性或阴性、HBV DNA检测不到、肝脏生化指标(如ALT)正常、肝组织病变改善则为临床治愈[5]。血清HBsAg转阴后HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)仍持续存在于肝，肝内仍存在低水平的HBV复制[6]，且存在HBV再激活和发生HCC的风险。有研究[7]统计，2946例CHB患者HBsAg消失后发生肝细胞癌的风险约为4.0%。

在发生慢性HBV感染者体内，CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞应答在质量和数量上发生变化[8]，甚至会出现CD8+T淋巴细胞应答的严重缺陷，病毒特异性CD8+T淋巴细胞通常无法分化为记忆性CD8+T淋巴细胞[9]，HBV特异性T淋巴细胞的检出频率显著降低[10]。以上研究提示功能性T淋巴细胞持续暴露于高水平的病毒抗原引起T淋巴细胞耗竭[11]，这是病毒持续存在的主要促成因素[12]。PD-1是耗竭型T淋巴细胞主要表达的抑制性受体，研究[12]发现PD-1/PD-L1信号通路可以调节慢性HBV感染者体内免疫细胞的功能。对CHB患者的纵向分析[13-14]显示，PD-1和PD-L1表达水平在炎性发作期显著升高，在炎症消退时逐渐降低。因此，PD-1在CHB患者体内T淋巴细胞的表达情况可能具有重要意义。

近来，有研究[15]证明部分CHB患者病毒抗原水平下降对病毒特异性免疫功能恢复有利。本研究对CHB临床治愈者外周血中T淋巴细胞PD-1表达情况进行分析，探究临床治愈者体内病毒特异性免疫的恢复情况，并分析血清可溶性PD-1(soluble PD-1, sPD-1)和sPD-L1水平[16-17]与T淋巴细胞PD-1表达情况的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2022年1月—5月在本院感染疾病科门诊诊断的CHB临床治愈者。入选标准：(1)年龄18～70岁；(2)HBsAg阴性以及HBV DNA低于检测值下限(20 IU/mL)；(3)抗病毒治疗时间>6个月。出现以下任何一种情况即排除：(1)非HBV原因导致的慢性肝脏疾病，例如HCV感染、HDV感染、重度脂肪肝、酒精性肝病、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、遗传代谢性肝病等；(2)HIV感染；(3)合并恶性肿瘤患者(不包括已治愈者，包括原发性肝癌)；(4)合并心、肺、肾、脑、血液等重要脏器严重疾病伴功能不全者。经以上入排标准筛选，总共纳入26例临床治愈者。

同时纳入了26例CHB初治患者进行比较。入选标准：(1)年龄18～70岁；(2)HBsAg阳性>6个月；(3)未进行抗病毒治疗。排除标准同CHB临床治愈者。另外纳入26例健康对照者。

1.2 研究方法 收集CHB初治患者、CHB临床治愈者和健康对照者的基本信息和各项临床数据，包括生化指标及病毒学检查指标。

1.3 标本收集及检测 收集CHB初治患者、CHB临床治愈者和健康对照者的外周血样本。使用流式细胞技术检测外周血T淋巴细胞及PD-1表达情况，使用FITC anti-human CD3 Antibody (美国，Biolegend公司)标记外周血T淋巴细胞，使用PE anti-human CD8 Antibody(美国， Biolegend公司) 标记外周血T淋巴细胞中的CD8+T淋巴细胞，使用APC anti-human CD279 (PD-1) Antibody (美国，Biolegend公司)标记PD-1+淋巴细胞。使用ELISA法检测血清sPD-1和sPD-L1 (美国，R&D Systems 公司)。

1.4 统计学方法 数据分析采用SPSS 22.0统计软件。非正态分布计量资料采用M(P25～P75)表示，sPD-1和sPD-L1及抗-HBs的水平经log10变换后使用M(P25～P75)描述，3组间比较采用Kruskal-WallisH检验。计数资料3组间比较采用χ2检验。使用Pearson相关或Spearman相关进行两个连续变量之间的相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB初治患者、临床治愈者与健康对照者的特点分析 CHB临床治愈者平均抗病毒治疗时间约8.33年，抗病毒治疗药物均为恩替卡韦。CHB初治患者HBsAg水平为2.51(1.74～3.31) log10IU/mL，HBV DNA为 1.42(1.30～2.53) log10IU/mL，HBeAg阳性7例。临床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平显著高于健康对照者(P值分别为0.029、<0.001)。然而临床治愈者血清sPD-1和sPD-L1水平与CHB初治患者水平相似，差异无统计学意义(P值均>0.05)(表1)。

临床治愈者的T淋巴细胞/淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞、PD-1+细胞/淋巴细胞、PD-1+CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞与健康对照者水平相似，差异无统计学意义(P值均>0.05)。而CHB初治患者的PD-1+细胞/淋巴细胞、PD-1+CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞显著高于临床治愈者(P值分别为0.040、0.016)(表1)。

表1 CHB患者和健康对照者临床特点分析

2.2 健康对照者血清sPD-1和sPD-L1与各指标的相关性分析 健康对照者血清sPD-1水平和年龄、性别、ALT、T淋巴细胞/淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞、PD-1+细胞/淋巴细胞、PD-1+CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞均无相关性(P值均>0.05)，sPD-L1也是类似结果(表2)。

表2 健康对照者血清sPD-1和sPD-L1与各指标的相关性

2.3 CHB初治患者血清sPD-1和sPD-L1与各指标的相关性分析 结果提示CHB初治患者血清sPD-1、sPD-L1与HBsAg水平均呈中等程度负相关(r值分别为-0.524、-0.583，P值均<0.05)。血清sPD-1、sPD-L1水平和PD-1+CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞具有中等程度的正相关(r值分别为0.535、0.419，P值均<0.05)。血清sPD-1和sPD-L1水平与其他指标均无相关性(P值均>0.05)(表3)。

表3 CHB初治患者血清sPD-1和sPD-L1与各指标的相关性

2.4 CHB临床治愈者血清sPD-1和sPD-L1与各指标的相关性分析 CHB临床治愈者血清sPD-1水平和年龄、性别、ALT、T淋巴细胞/淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞、PD-1+细胞/淋巴细胞、PD-1+CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞均无相关性(P值均>0.05)，sPD-L1也是类似结果(表4)。

表4 临床治愈CHB患者血清sPD-1和sPD-L1与各指标的相关性分析

3 讨论

CHB初治患者中血清sPD-1、sPD-L1水平与外周血PD-1+CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞之间存在中等程度的正相关性，提示CHB初治患者血清sPD-1、sPD-L1水平主要与外周血PD-1+CD8+T淋巴细胞有关，外周血病毒特异性耗竭型CD8+T淋巴细胞比例越高，血清sPD-1、sPD-L1水平越高。然而CHB临床治愈者、健康对照者未见到血清sPD-1、sPD-L1水平与PD-1+CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞显著的相关性，提示CHB临床治愈者、健康对照者体内sPD-1、sPD-L1水平可能主要来源于外周血以外。有研究[18-19]发现超过90%的肝脏浸润的HBV特异性CD8+T淋巴细胞中可检测到PD-1阳性。

本研究中临床治愈者的外周血PD-1+细胞/淋巴细胞、PD-1+CD8+T淋巴细胞/淋巴细胞显著低于CHB初治患者，提示临床治愈者外周血耗竭型CD8+T淋巴细胞减少。这可能是因为临床治愈者随着病毒载量和抗原水平降低，体内部分病毒特异性T淋巴细胞功能恢复。然而与健康对照者相比，临床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平仍显著高于健康对照者。这可能与CHB临床治愈者体内耗竭型病毒特异性T淋巴细胞主要存在于肝内[20]有关。由于HBV cccDNA以及HBV整合DNA的存在，临床治愈者虽然血清检测不到病毒和抗原，但肝内还在发生病毒复制[21]，使得肝内病毒特异性T淋巴细胞只能恢复部分功能。因此，血清sPD-1和sPD-L1可能可以反映肝内病毒特异性T淋巴细胞恢复情况，尤其是CHB临床治愈者这种外周血T淋巴细胞功能部分恢复的情况，值得进一步研究验证。

在CHB初治患者体内，血清sPD-1、sPD-L1和HBsAg水平呈中等程度负相关，sPD-1和sPD-L1水平越高，HBsAg水平越低。这可能是因为CHB初治患者病毒抗原水平较高，使得病毒特异性T淋巴细胞的耗竭主要表现为数量减少。

综上，本研究发现临床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平高于健康对照者,这可能与临床治愈者肝内仍持续发生病毒复制有关，使得肝内病毒特异性T淋巴细胞功能仍受到抑制。通过检测血清sPD-1和sPD-L1可能可以反映临床治愈者肝内病毒特异性免疫恢复的情况。

伦理学声明：本研究于2021年1月13日由北京大学第一医院伦理委员会批准，伦理审查编号：2020科研363。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：谭宁负责数据收集，统计分析，撰写文章；刘建湘负责资料分析，拟定写作思路，撰写文章；谭宁和刘建湘贡献等同，为共同第一作者。亢倩、潘家莉、韩一凡、陈宏宇参与收集数据和分析；徐小元负责指导撰写文章并最后定稿。