以肠道菌群为靶点治疗原发性胆汁性胆管炎的临床应用

马铭涵， 刘彦琦

内蒙古医科大学附属医院 消化科， 呼和浩特 010050

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种以肝内胆管上皮细胞(biliary epithelia cell，BEC)为特征性靶标的具有器官特异性的自身免疫相关肝病。现今全球多个国家及地区的流行病学分析均显示其患病率呈逐年增长趋势[1]。虽然PBC属于自身免疫性疾病，但免疫抑制剂、生物制剂暂未发现明显效益[2]，对失代偿或严重顽固瘙痒的患者，根本上改善生存率的方法只有肝移植(LT)[3]。“疾病肠治”是近年研究热点，研究人员从微生态角度出发，以肠道菌群为靶点，探究未来是否可通过重塑肠道微环境，干预PBC疾病进展。

1 PBC治疗现状

熊去氧胆酸(UDCA)是唯一被批准用于PBC治疗的一线药物，它被证实可以延长无LT生存期，并且与发生肝脏相关疾病风险降低有关[4]。虽然一经确诊即开始口服UDCA，但仍有部分患者病情可能会进展，如：对UDCA应答欠佳、耐受性差或依从性差的患者，他们仍将面临较高肝脏相关死亡及并发症的风险[5]。目前新靶点、新药物很多，但已明确疗效及安全性的二线药物仍较少。因此，当前亟待解决的重要问题即寻找安全、有效的二线药物，来降低PBC患者的LT需要率及死亡风险。

2 肠道菌群与PBC

近些年高通量测序、宏基因组测序等前沿技术的开发应用，肠道菌群基因组、核心菌群分布特点越来越清晰。“肠-肝轴”预示着肠道微环境作为一个新角色参与多种肝脏疾病[6]。免疫受损、胆汁酸(bile acids，BA)代谢紊乱共同介导PBC的胆管损伤。而肠道菌群与免疫稳态，BA与菌群的交互调节增加了PBC的患病风险。PBC地理聚集特点及病因学同样显示环境触发及肠道微生物是潜在危险因素[1]。但肠道微生态的改变是原因还是结果，目前尚未可知。

2.1 “肠漏”假说 生理状态下，肠黏膜能够分泌黏液、抗菌肽等物质，肠壁内、上皮间及黏膜固有层分布着多种免疫细胞及淋巴组织，肠内共生微生物还具有拮抗病原菌的作用。这些“屏障”可以有效防御致病物质，共同维持机体免疫稳态[7]。门静脉收集来自肠道的血液，肝脏是过滤肠源性毒素和物质的前线。正常免疫防御下部分微生物抗原随循环进入肝内不会导致疾病发生。但当肠道菌群失调导致肠道运动障碍和炎症，屏障功能受损，潜在致病性物质、细菌易位到肝内胆道系统，将可能引发BEC损伤凋亡、肝内炎症及纤维化重塑[7-8]。对dnTGFβRIITLR2-/-小鼠结肠免疫荧光染色发现肠上皮紧密连接蛋白表达下调并伴随菌群紊乱，肝内T淋巴细胞浸润和胆管损伤程度相对于未敲除TLR2小鼠更加严重。并且在抗生素干预后得到缓解，菌群失调也得以改善[9]。而PBC患者受损胆管中检测到属于细菌壁成分的脂磷壁酸，同样证实了细菌易位和疾病发展间的关联[8]。

2.2 异常肠道淋巴细胞归巢 与“肠漏”假说平行，Grant等提出了另一种“肠道归巢”假说[10]。生理条件下，趋化因子(chemokine ligand，CCL)25和内皮黏附分子(mucosal addressin cellular adhesion molecule 1，MAdCAM-1)的表达主要局限于肠道相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissues，GALT)。它们通过特定的趋化因子受体和整合素诱导T淋巴细胞向肠道募集，这种趋向性是由肠树突状细胞表达的视黄醇氢化酶诱导的，肝树突状细胞并不具备这种能力。而原发性硬化性胆管炎合并炎症性肠病患者(primary sclerosing cholangitis-inflammatory bowel disease，PSC-IBD)肝内CCL25和MAdCAM-1表达增加。PBC中也有相似表现[10-11]。但机制暂未阐明，起初认为这种“归巢”是自身免疫相关肝病，为PSC-IBD特有，但最近发现这种T淋巴细胞的肝脏募集是慢性肝病的共同特征。在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和刀豆蛋白A诱导的肝炎小鼠模型中MAdCAM-1消融带来肝内氧化应激和炎症的改善。并且在NASH中阻断整合素α4β7可减轻肝脏炎症和纤维化[11]。此外，肠道IgA能够促进共生细菌同时抑制病原菌，参与维持肠道稳态。分泌IgA的浆细胞来源于GALT中的B淋巴细胞。整合素α4β7还调节IgA浆母细胞向肝脏迁移。Li等[12]和Moro-Sibilot等[13]发现除了肠黏膜外，肝脏是IgA反应的替代效应位点。PBC、PSC患者血清IgA常呈现升高同样暗示着肠道的潜在参与。

2.3 交叉反应和分子模拟 抗线粒体抗体(AMA)是PBC的标志物之一，能够特异性识别丙酮酸脱氢酶复合物E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex，PDC-E2) 硫辛酸结构域。PBC典型免疫病理特征即针对PDC-E2的免疫耐受丧失，选择性破坏BEC[14]。许多微生物都与人PDC-E2(hPDC-E2)具有高度相似的抗原表位，它们通过分子模拟触发免疫系统错误定位，启动针对胆管的自身免疫反应。大肠杆菌(E.coli)PDC-E2被证实能够与hPDC-E2硫辛酸结构域交叉反应。还有ATP依赖性Clp酶等多种E.coli微生物蛋白都与hPDC-E2具有高度相似的氨基酸序列。利用E.coil感染的NOD.B6 Idd10/Idd18小鼠呈现类似PBC的自身抗体和肝脏病理表现。PBC中由E.coil引起的尿路感染的患病率高于其他慢性肝病，并且复发性尿路感染者AMA阳性比例也相对更高[15]。由此可见分子模拟机制与PBC发病密切相关。环境中普遍存在的新鞘氨醇杆菌属溶芳炝单胞菌(N.Aromaticivorans)内部结构域的氨基酸序列208-237与hPDC-E2具有高度的同源性。N.Aromaticivorans的两种脂酰化细菌蛋白50 kD和47 kD在100%AMA阳性和12%AMA阴性患者中血清反应滴度上升，并且效价比E.coil至少高出100倍。此外，德氏乳杆菌、肺炎克雷伯菌等都能与AMA交叉反应，但它们的定位位点仍待明确[16]。

2.4 肠道菌群与BA的串扰 作为重要的信号分子，BA参与脂质及脂溶性维生素在肠道的消化、吸收等代谢过程，并且能够通过信号通路影响免疫调节。初级BA在肝内合成随胆汁到达肠道，在微生物的修饰下转化成次级BA。其中至少95%通过回肠有机溶质转运体、顶端钠依赖性转运体主动重吸收或结肠被动重吸收。然后它们被有机阴离子转运肽和Na+/牛磺胆盐共转运体再摄取到肝细胞中，随新一轮BA一起通过胆盐输出泵再次排入肠道完成肠-肝循环，不断地往复补足机体生理需要[17-18]。

BA多种化学结构之间的转化离不开氨基酸的结合和菌群的生物修饰。因此，菌群发生变化必定会干扰BA池的组成及大小。脱羟基化、脱水、差向异构及氨基酸的去结合是已知的4种微生物对BA的转化机制。最近研究[19]还发现了第5种机制——胆碱骨架与氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸的酰胺共轭。研究[12]发现无菌小鼠与传统饲养小鼠的BA池存在差异。传统饲养小鼠BA池相对较小且牛磺-β-鼠胆酸比例减少。此外，肠道微生物群还通过法尼醇X受体 (farnesoid X receptor，FXR)调节BA合成途径酶的活性[10]。它们通过调节肠道FXR mRNA的表达，诱导下游成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)15/19表达减少，负调控胆固醇7α羟化酶的活性，从而干扰BA的合成[12]。研究[19]表明FXR-/-小鼠肠道通透性增加，肠黏膜完整性降低，并且缺失菌群对BA的调控作用。

不仅肠道菌群可以调节BA，反之亦然。BA通过自身毒性以及FXR和G蛋白偶联胆汁酸受体(transmembrane G protein coupled receptor，TGR5)直接或间接影响肠道微生态。疏水性BA毒性作用诱导细胞凋亡、坏死破坏肝脏及肠道稳态主要通过3种机制。其一，直接诱导线粒体和内质网氧化应激启动凋亡、衰老。BEC的凋亡会导致阴离子交换蛋白2表达减少，从而影响碳酸氢盐屏障。其二，直接激活死亡受体Fas和TRAILR-2，然后caspase 8激活，促凋亡蛋白Bid裂解、易位，最终导致细胞不可逆死亡。其三，具有洗涤作用，能够直接破坏细胞膜，导致细胞崩坏裂解[10]。这也使BA表现出特殊的抗菌性。毒性胆汁淤积抑制对BA敏感的菌群，而E.coil等可耐受胆盐压力菌群则占据主导地位。这些潜在致病细菌能在炎症条件下增殖并导致炎症或影响自身免疫[20]。

BA是FXR的内源性配体，BA的积聚会导致FXR激活，而FXR通过下调BA合成酶表达，减少BA合成并增加BA的转运，导致肝细胞内BA水平降低，从而负调节BA诱导的FXR活化[21]。除了FXR-FGF15/19-CYP7A1信号通路，FXR还是回肠有机溶质转运体、顶端钠依赖性转运体的负调控因子。此外它还上调胆盐输出泵的表达，减少肝细胞在毒性BA中的暴露[18]。PBC二线药物奥贝胆酸即通过激动FXR负调控BA合成。另外研究[13]发现其具有部分预防肠道屏障功能障碍，减轻肠道炎症的作用。膜结合型BA受体TGR5由肠内分泌L细胞分泌。TGR5激活后触发下游胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的释放。而GLP-1能够防止BEC凋亡，促进其对胆汁淤积的增殖修复。BA螯合剂消胆胺可以结合肠腔中的BA，因此被认为能够影响肠道菌群。最近一项研究[22]发现消胆胺可以调节FXR信号通路，并且还增强TGR5的肠道内激活，进而发挥胆管保护作用。一线药物UDCA是一种亲水性BA，其疗效及安全性已被大量研究证实。PBC经UDCA处理后BA结合/非结合和初级/次级比值逆转[23]。Tang等[20]发现PBC患者肠道物种丰富度降低并且整体多样性的显著变化。使用UDCA 6个月后患者肠道富集的嗜血杆菌属、链球菌属和假单胞菌属减少，未减少的韦荣菌属可能与患者对UDCA应答欠佳有关。而健康对照组中拟杆菌属、萨特菌属和颤螺菌属在治疗后扩增。这证实了UDCA 可以缓解部分微生物失调。

3 微生态制剂与PBC

目前以“肠-肝轴”为核心机制，肠道微生物群为靶点的治疗策略，已在NASH、肝性脑病等疾病中取得一定进展[24-25]。微生态制剂可以通过直接增加肠道内有益菌丰度，产生抗菌物质，阻止致病菌增殖，使肠屏障功能得以改善，重塑肠道微环境，增强免疫防御[26]。鼠李糖乳杆菌GG(lactobacillus GG，LGG)是一种革兰阳性菌，是目前研究相对较多的益生菌之一。研究[27]表明LGG能够通过上调肠道FXR及FGF15表达活性，抑制BA从头合成。LGG负反馈减少肝内BA产生，并且影响肠道微生物群，改善胆管结扎小鼠的肝内炎症、BA水平及纤维化。并且使用FXR拮抗剂后上述现象受到阻碍[25]。目前，联合使用微生态制剂干预PBC肠道菌群的研究[23]结果表明使用益生菌干预后肠道内呈现有益菌属丰度相对增加，潜在致病菌减少趋势。此外，患者血清促炎细胞因子及纤维化指标较对照组减低，这意味着引入有益菌使内部菌群向健康人群肠道转变，对延缓疾病进展有帮助[28]。其他国内、外相关研究正在进行或计划中(NCT03521297)。

微生态制剂治疗一直是近年来极具争议的话题。益生菌的剂量及菌种，菌群移植等研究目前仍在不断探索。益生菌在PBC患病中的相关机制仍然需要大量临床前数据来阐明。以肠道菌群作为突破口、菌群为靶标的治疗有望在未来打破PBC治疗方案较少、较单一的问题，成为PBC新的治疗策略。

4 总结与展望

PBC肠道菌群与免疫防御，BA合成、代谢过程的相关性越来越清晰明了。肠道微生态与PBC之间的深入研究能够为治疗提供更多选择。但如何科学合理地在现有治疗策略上应用微生态制剂将是未来需要继续探索的问题。另外，使用肠道菌群作为靶标还面临许多不足及难点需要解决。菌群与遗传、年龄、性别、环境等因素相关，并且随着生活方式的改变易出现动态变化。因此，肠道菌群如何作为精准医疗的靶标个性化用药，还需多种族、长时间、多中心研究来明确。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：马铭涵负责撰写文章及修改；刘彦琦负责指导及校正。