形觉剥夺性近视的视网膜调控机制研究进展△

冯娇娇 宋继科 毕宏生

形觉剥夺性近视(FDM)是近视研究的主要动物模型之一,通过使视网膜成像障碍(失去对比度及空间频率),从而导致眼轴增长形成近视[1]。形觉剥夺学说认为眼轴伸长是一种在神经和生物活性物质调控下的眼球主动重塑的过程,主要是玻璃体的伸长,并伴有视网膜、脉络膜和巩膜变薄[2-3]。研究发现,在视觉发育期间,任何使视网膜成像障碍的条件均会引起FDM,由于先天性白内障[4]、角膜炎[5]、上睑下垂[6]以及视网膜神经节细胞轴突的持续髓鞘化[7]导致的形觉剥夺引发的近视,其机制可能与在动物体上观察到的FDM的机制类似。因此,本文将总结近年来与FDM视网膜发病机制相关的神经递质和离子以及最新的FDM相关的视网膜组学的研究进展,从而就FDM发生的视网膜调控机制做一综述,以期为FDM视网膜调控机制的进一步研究提供新见解,为药物治疗近视探索潜在干预靶点提供新思路。

1 FDM动物模型研究进展

1977年,Wiesel等[8]通过缝合恒河猴幼猴眼睑,最早建立了FDM模型。不久后,又通过缝合树鼩[9]、雏鸡[10]、猫[11]、兔[12]、鼠[13]的眼睑成功诱发了FDM,以及新生猕猴由于角膜混浊也造成了眼轴伸长[14]。随后的研究中使用塑料护目镜[15]、乳胶面罩[16]、基于尼龙搭扣[2]或头戴式底座将半透明弥散片固定在眼部来诱导FDM[17]。由于眼球结构和正视化机制与人类近视相似,豚鼠被广泛用于目前的近视研究[18]。近视的程度和眼球伸长率因物种而异。在10 d的形觉剥夺后,模型鸡眼近视屈光度可达到-17 D[19],而灵长类动物在17周的形觉剥夺后近视屈光度为-5～-6 D[20],这可能是由于实验方法的差异、形觉剥夺的持续时间、动物模型之间固有的眼部解剖等的差异。尽管如此,FDM在如此广泛的动物中发生的事实表明,从进化的角度来看,导致FDM的眼部生长调节的视觉依赖机制是普遍存在的,并且该机制在物种间可能是保守的[21]。

2 FDM的视网膜调控机制

1991年,Schaeffel等[22]最先提出FDM是一种“开环”病,近视是由于缺乏来自形觉剥夺的视网膜的视觉反馈和没有定义的屈光终点而导致眼部生长不受限制的结果。值得注意的是, FDM是一种分级现象,轴性近视的程度与视网膜图像对比度的降低程度呈正相关。即使是视网膜成像质量的轻微失真也可能导致一定程度的近视[23]。剥夺视网膜图像的亮度或高敏锐度视觉会产生轴性近视,清晰、高对比度的视网膜图像对于眼部的正常生长至关重要[1]。

导致眼球过度伸长最初的生物化学信号级联发生在视网膜,但视网膜神经网络对异常视觉输入改变眼部生长的机制尚不清楚。动物模型研究表明,视网膜成像模糊会引发信号级联反应,从而导致视网膜和视网膜色素上皮(RPE)发生大量细胞和生物化学变化[24],视网膜神经元会分泌大量的生长调节神经递质,如多巴胺(DA)、视黄酸(RA)、血管活性肠肽(VIP)和黑视蛋白等,从而向脉络膜以及巩膜发出信号导致眼球整体生长和屈光状态发生变化。视网膜是该视觉信号的重要组成部分,因为它是视觉感知的第一层光敏神经元。此外,研究表明,切断雏鸡[25]和豚鼠[26]的视神经并不能阻止它们FDM的发展。这表明,眼球生长的视觉调节主要发生在视网膜。

2.1 视网膜DA机制

DA是包括人类在内的所有脊椎动物视网膜中的主要儿茶酚胺。 DA由酪氨酸经酪氨酸羟化酶转化为左旋多巴,再经左旋多巴脱羧酶的作用转化而成,细胞质中的DA由囊泡单胺转运体转运至突触小泡,释放后与DA受体结合启动信号转导。基于它们在靶细胞中调节环磷酸腺苷产生的能力,DA受体分为D1样家族和D2样家族(分别为D1R和D2R),它们的刺激会增加或减少细胞内环磷酸腺苷水平,并相应地上调或下调蛋白激酶A[27]。 DA由多巴胺能无长突细胞和网间细胞合成和释放,这些细胞占无长突细胞群的比例低于1%[28]。 DA的释放受到光照水平的强烈影响,具有昼夜节律,白天释放较高,夜间释放较低[29]。 DA被认为在光适应中通过控制细胞耦合和调节视网膜的昼夜节律发挥神经调控作用[30]。在FDM实验诱导的眼部生长和屈光状态的改变中, DA途径代谢产物的变化以及多巴胺能药物对实验诱导的近视影响表明了 DA在眼部生长调节中的作用。目前,常用的检测视网膜中DA水平的方法是高效液相色谱法(HPLC),这种方法只能检测到总的DA水平,因此,以高空间分辨率直接观察视网膜中的DA对于了解其分子与FDM发展过程中的生物化学机制至关重要。 Ren等[31]研发了一种基于表面增强拉曼散射的纳米探针,该探针已应用于FDM豚鼠的活细胞和视网膜组织中的DA成像,并进一步研究了FDM小鼠视网膜的DA水平,结果表明,经过2周形觉剥夺后,FDM豚鼠和FDM小鼠视网膜中的DA水平均下降,这与近视的发展有关。

大量的药理学研究支持DA在FDM发生发展中的作用[32-36]。Thomson等[32]研究发现,每天在鸡玻璃体内注射DA或多巴胺能激动剂可以剂量依赖性地抑制FDM的发展。进一步研究表明,通过局部滴眼液给药也可以抑制雏鸡FDM的发展[33]。Landis等[34]评估了全身性 L-3,4-二羟基苯丙氨酸注射对 C57BL/6J小鼠FDM的影响,结果表明,内源性增加DA合成和释放可预防小鼠发生FDM。为了研究DA受体在FDM发生发展中的作用,Zhang等[35]将D1R (SKF38393)和 D2R(喹吡罗)的激动剂及相应的拮抗剂(SCH23390 和舒必利)对FDM豚鼠进行球周注射,具有电化学检测功能的HPLC定量测量了视网膜和玻璃体中DA水平及其代谢产物 4-二羟基苯乙酸水平,结果表明,在FDM豚鼠视网膜中D1R激活受到抑制,而D2R激活增强。Huang等[36]研究通过在C57BL/6小鼠腹腔内注射D2R全激动剂喹吡罗和D2R部分激动剂阿立哌唑后发现,喹吡罗在低剂量时能抑制FDM的发展,而在高剂量时则促进FDM的发展,这种双向效应被D2R的特异性所验证。 D2R部分激动剂阿立哌唑在高剂量时减弱了FDM的发展,但在低剂量时并没有此作用。因此, D2R介导的信号转导能力的降低有助于近视的发展。

如上所述,无论以何种方式增加内源性DA的合成和释放均可抑制FDM,且D1R在FDM中的抑制与D2R的激活也已被其相应的激动剂和拮抗剂所证实。

2.2 视网膜RA机制

RA是维生素A的衍生物,是视网膜光感受器细胞中视蛋白结合物视黄醛的最终代谢产物,主要由RPE细胞合成[37]。目前,RA发挥作用的经典途径主要以全反式的形式,全反式视黄酸(atRA)是RA的一种活性形式。全反式视黄醇经视黄醇脱氢酶氧化生成全反式视黄醛,再经细胞质视黄醛脱氢酶氧化成atRA。核RA受体(RAR)和RA的X受体的二聚体与atRA结合,随后与DNA结合并影响转录。合成后,atRA可以与许多RA结合蛋白中的一种结合,以促进细胞内或细胞外转运或由细胞色素P450亚家族26代谢[38]。

早期大量研究已证实,FDM雏鸡[39]、FDM豚鼠[40]和FDM绒猴[41]视网膜中RA和视黄醛脱氢酶2水平升高,并且在从FDM中恢复期间,视网膜RA水平受到抑制[40]。Huang等[42]利用HPLC测量RA水平,并通过蛋白质印迹和实时PCR测定形觉剥夺2周后豚鼠视网膜中RA结合蛋白I(CRABP-I)和RAR-β的表达,结果发现,视网膜RA水平迅速升高,CRABP-I和RAR-β表达紧随RA增多之后也增多。毛玉梅等[43]研究发现,形觉剥夺4周后,豚鼠视网膜RPE细胞内视黄醇脱氢酶5(RDH5)基因在转录和蛋白水平的表达均下调,其可能机制是在近视发展过程中体内RA含量增多,呈负反馈地调节RDH5基因的表达。Zhang等[44]研究发现,atRA能增加人RPE细胞表达转化生长因子-β2(TGF-β2),而且atRA通过磷脂酶C信号通路而非腺苷酸环化酶信号通路刺激RPE细胞分泌TGF-β2,磷脂酶 C 抑制剂(U73122)可抑制atRA并促进近视发展。另外,RA是目前研究中唯一在FDM动物模型中于视网膜、脉络膜及巩膜中均发生变化的信号分子[24,45]。

总之,视网膜和脉络膜RA合成的变化以及RA对巩膜生长的影响表明,RA在FDM调节中具有重要作用,它既可能是从视网膜到巩膜信号级联的一部分,也可能是巩膜细胞外变化的效应器,需要进一步的研究来阐明参与调节视网膜和脉络膜RA合成及其对巩膜调节的分子机制。

2.3 视网膜VIP机制

VIP是一种28个氨基酸的神经肽,属于胰高血糖素/分泌素超家族,这种配体与VIP受体2(VIPR2)结合并激活VIPR2,进而增加心肌的收缩能力和糖原分解,以及其他生理活动[46]。VIPR2广泛存在于角膜、视网膜、RPE、脉络膜和巩膜,VIPR2功能障碍可能促进近视的发展[47]。有研究表明,FDM猴[48]、FDM鸡[49]和FDM豚鼠[50]的视网膜中VIP基因和蛋白表达水平增加。这些结果表明,VIP-VIPR2 信号通路的激活可能导致近视。Zhao等[51]在FDM小鼠模型中发现,形觉剥夺眼视网膜双极细胞VIP基因的表达呈现早期显著下调的趋势,这与先前的大多数研究不同。进一步的药理学实验发现,与载体对照相比,应用选择性VIPR2拮抗剂PG99-465会促进近视发展,而选择性VIPR2激动剂RO25-1553则会抑制近视进展,且在VIPR2基因敲除小鼠中屈光度显著偏向近视。以上研究均证实了VIP-VIPR2信号通路在FDM中的重要作用。

VIP基因在FDM模型视网膜中的表达不一致可能是由于先前的研究集中在视网膜总mRNA及蛋白水平的变化上,而Zhao等[51]的研究是利用单细胞RNA测序技术发现了在双极细胞中VIP基因的表达在FDM早期下调,且实验动物物种和形觉剥夺持续时间也有所不同。这些不同的结果表明,VIP-VIRP2对近视的调节是复杂的,还需要更多的研究来阐明它在FDM发生发展过程中的具体机制。

2.4 视网膜黑视蛋白机制

黑视蛋白是脊椎动物中由视蛋白4(opn4)基因编码的G蛋白偶联视蛋白,与其他视蛋白不同,黑视蛋白不参与视网膜外层光感受器的光转导,但对光敏感[52]。最近,已有研究发现,内层视网膜中的固有光敏视网膜神经节细胞(ipRGC)中含有黑视蛋白,并且与昼夜节律的调节密切相关[53]。Liu等[54]使用黑视蛋白抗体通过定量蛋白质印迹分析测试了FDM小鼠视网膜中的黑视蛋白水平发现,形觉剥夺眼ipRGC的黑视蛋白表达水平及其介导的光反应幅度均出现显著上调,而ipRGC消融或将黑视蛋白敲除,以及将小鼠饲养于480 nm波长光(黑视蛋白的最大激发波长)缺如的环境中造成黑视蛋白激活程度下调后,形觉剥夺诱导近视的效应显著减小。然而,Chakraborty等[55]利用黑视蛋白基因敲除(opn4-/-)的小鼠研究了黑视蛋白对正常屈光发育和FDM的影响,结果发现,与野生型小鼠相比,在正常环境中饲养的opn4-/-小鼠在4周后近视更明显,而在形觉剥夺3周后,opn4-/-小鼠的近视程度比opn4+/+小鼠更大。 两项研究结果不一致的原因可能在于一些方法学的差异,例如用于消融ipRGCs的技术,形觉剥夺的时间以及对照组的处理方式等。

以上研究结果表明,黑视蛋白信号通路在小鼠正常屈光发育和FDM进展中均有潜在作用,然而其具体机制尚未阐明。并且,目前的研究仅局限在小鼠这个实验模型中,仍需进一步研究黑视蛋白在其他FDM实验动物模型中的作用,以期进一步探究其具体的调控机制。

2.5 视网膜离子驱动外排机制

Crewther[56]提出了导致近视的视网膜离子驱动外排(RIDE)理论,该理论认为形觉剥夺会扰乱光感受器和视网膜下空间之间的离子和液体交换速率,同时影响神经递质传递、组织渗透压调节和代谢通路。有研究通过电子显微镜和相对钠离子和氯离子丰度对雏鸡形觉剥夺视网膜及脉络膜组织进行超微结构观察表明,雏鸡眼2周的形觉剥夺会导致异常的眼球延长,伴随视网膜厚度和脉络膜厚度减少30%;该研究指出,脉络膜变薄可能是由于血管和淋巴管的管腔收缩,以及脉络膜毛细血管的小血管密度显著降低[57]。而去除形觉剥夺会导致整个视网膜和脉络膜的血管外水肿,从最大水肿程度中恢复的过程是从视网膜开始的,然后再发生于脉络膜[58]。形觉剥夺2周后雏鸡脉络膜、RPE和光感受器外段(OS)的钠离子丰度和氯离子丰度明显高于对侧眼的相同区域。然而,脉络膜中钠离子丰度和氯离子丰度的变化大于RPE和OS,RPE、OS和脉络膜的钠离子和氯离子丰度在去除形觉剥夺48 h内均能恢复到正常范围,但氯离子比钠离子恢复得更快。因此,外部视网膜和RPE显示出高渗透压的迹象[58]。Crewther等[59]应用能量色散X射线微量分析发现,形觉剥夺2周后,雏鸡视网膜中钾离子丰度升高,包括OS、视网膜下空间和RPE中,以及整个视网膜和脉络膜的钠离子和氯离子均升高,该结果与以上研究结果一致。这些结果证明,表征FDM的生物特征和超微结构变化与外层视网膜/RPE中钾离子丰度显著升高以及视网膜所有层中钠离子和氯离子的高丰度有关。Yang等[60]在FDM豚鼠中的研究发现,形觉剥夺4周后,豚鼠视网膜中的钾离子浓度显著升高,进一步证实了Crewther等[59]的研究结果。Giummarra等[61]利用基因集富集分析发现,早在雏鸡形觉剥夺后6 h和72 h,线粒体能量代谢、神经传递和随后参与离子稳态的基因通路变化与轴向伸长和屈光变化紧密相关。FDM早期恢复期间胆汁酸代谢的抑制突出了维持近视中能量代谢的重要性。这些发现也为RIDE理论中视网膜和脉络膜变薄、轴向伸长和高渗离子分布模式提供了证据。

以上研究均已证实玻璃体、视网膜、RPE与脉络膜之间液体流动与离子交换在FDM的发生发展过程中发挥着重要作用,因此,抑制液体通过视网膜/RPE的正常流出会导致玻璃体体积增加、轴向伸长并诱发屈光状态变化,从而导致近视。

2.6 FDM视网膜相关组学研究

早期的研究已经确定了几个基因和视网膜物质在FDM发生发展过程中起重要作用[31,42,48-51],然而这些研究仅能解释发生形觉剥夺时视网膜的微观结构或局部改变,无法从全局的角度观察视网膜的整体改变。近年来,通过转录组学[62]、蛋白质组学[63]和非小编码RNA(miRNA)组学[64]研究发现,形觉剥夺诱导的眼轴伸长其潜在生长调节因子显著增多,这些研究通过富集分析揭示了可能构成眼部生长调节新的生物化学信号通路。Vocale等[62]使用RNA转录组测序技术研究发现,形觉剥夺7 d后雏鸡视网膜γ-氨基丁酸和甘氨酸介导的氯离子转运途径的抑制是唯一显著改变的生物化学途径,这个发现在一定程度上支持 RIDE 理论。近视可引起视网膜变性,Zeng等[65]建立了豚鼠FDM诱发的早期视网膜变性模型,并利用RNA转录组测序技术研究了其作用机制,形觉剥夺15周后,FDM 视网膜中有152个基因表达上调,12个基因表达下调。京都基因和基因组数据库(KEGG)富集分析显示,FDM眼中酪氨酸代谢、ABC转运蛋白和炎症通路上调,而紧密连接、脂质和糖胺聚糖生物合成下调[65]。Yang等[66]利用气相色谱-飞行时间质谱仪对FDM豚鼠视网膜进行代谢组学研究发现,形觉剥夺3 d和2周后分别有11种和16种代谢物水平发生变化,表明FDM的发展与视网膜脂质生物合成下降、三羧酸循环周转以及葡萄糖积累的增加有关。Zhu等[63]利用同位素标记相对和绝对定量质谱技术(iTRAQ-MS)和所有理论光谱的顺序窗口采集质谱技术(SWATH-MS)的定量蛋白质组学技术,在FDM动物模型患眼和10.0 g·L-1阿托品治疗的患眼之间筛选出12种表达上调的蛋白质和17种表达下调的蛋白质,通过差异通路筛选了阿托品治疗FDM的潜在生物学途径包括真核起始因子2(EIF2)信号、糖酵解和DA的调节。有研究发现,在转录后水平下调靶基因的内源性miRNA与近视或其他眼部疾病中的眼部生长调控有关[64,67]。Mei等[64]从FDM小鼠的视网膜组织中筛选出了24个表达上调的miRNA,KEGG通路富集分析显示,轴突引导和TGF-β信号通路显著富集,另外,miR-466h-5p和miR-466j在一些与突触传递相关的生物学过程中显著富集。为了对FDM小鼠的miRNA表达谱进行全面的生物信息学分析,Liu等[67]对两个原始微阵列数据集(GSE58124和GSE84220)中差异表达的miRNA进行了功能富集分析和蛋白质相互作用分析,结果发现,FDM小鼠视网膜组织中,mmu-miR-1936和mmu-miR-338-5p表达均上调。因此,这些差异miRNA可能通过干扰其富集的途径或FDM进展中的生物学过程而发挥作用。

以上研究表明,在大规模组学研究中使用内外视网膜揭示了形觉剥夺启动的相似生物学机制。为了提高对形觉剥夺视网膜局部调控机制的理解,未来的研究需要整合在可比较的实验条件下收集的多个水平的组学数据。在相同动物模型中收集同步转录组学和蛋白质组学测量的研究也有助于阐明在这些研究类型中发现的倍数变化不一致是由于方法学因素(如表达谱分析的时间)还是翻译后事件。鉴于最近出现的下一代转录组学和蛋白质组学技术[68],例如单细胞原位蛋白质组学[69]、空间转录组学[70]等技术,未来的研究将会在重复性、敏感性和覆盖率方面产生更高质量的数据集。这些研究将为继续利用动物模型研究人类近视发生的生物学基础和开发新的治疗方法提供强有力的上游数据支持。

3 结束语

通过对FDM实验动物模型的研究,已经确定了如DA、 RA、 VIP、黑视蛋白等视网膜神经递质和RIDE机制在FDM的视网膜调控中发挥重要的作用。随着视网膜相关组学的进一步研究表明,形觉剥夺可触发视网膜信号级联反应,进而促进眼球生长,这一过程涉及一个复杂的网络信号通路,解决这一问题的方法是将近视分子水平研究发展到下一个层次,例如将空间转录组学与单细胞原位蛋白质组学相结合,从而确定蛋白质功能和调控基因表达的关系,这将是未来的研究方向。随着对实验模型研究的不断深入,可以更全面地了解形觉剥夺导致眼球生长的机制,包括涉及的神经回路、细胞和分子生物学机制,从而有助于推动新的、更有效的近视治疗方法的研发。