仿生石斛多糖对小鼠免疫器官的调节作用

李佳，郑紫莹，杨晓丽，白秭琳，田洋，白忠彬，3*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南省药食同源功能食品工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201）

石斛为兰科植物中的第二大属，包括铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxumLindl.）和流苏石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）的栽培品及其同属植物的近似种，具有重要的药用价值，是我国药食同源的植物[1]。由于大部分石斛对生长环境的要求极为苛刻，其自然繁殖率极低，并且生长缓慢，因此野生石斛的产量较为稀少[2]。林下仿生石斛的培养条件最接近于野生石斛的生长环境，其植株富含多糖、生物碱、氨基酸、矿物质元素等功能性物质，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血压、降血糖等多种生理作用[3-4]。

多糖是由单糖组成的生物大分子之一，具有抗肿瘤[5]、免疫调节[6]、心血管调节[7]、胃肠道调节[8]、抗氧化[9]等作用。免疫应答是机体免疫系统对抗原异物刺激所产生的生理过程能维持机体的平衡稳态。研究表明，一些具有免疫调节作用的功能活性物质，可以增强机体的获得性免疫、激活体内的免疫系统、提高对某些病毒和病菌的抵抗能力。因此，调节免疫活性已成为当下研究的热点。近年来，有大量文献研究表明，多种植物多糖具有免疫保护功能，如甘草多糖和艾叶多糖能够明显增强巨噬细胞内酶活性[10-11]；黑灵芝多糖能够激活树突状细胞的活性[12]；蝉拟青霉多糖、牛膝多糖以及地黄多糖等可以促进细胞因子分泌[13]；板蓝根多糖对淋巴细胞的增殖有促进作用[14]。可见，植物多糖能够增强机体的免疫功能，是有效的免疫增强剂和免疫调节剂。研究发现，林下仿生石斛的生理活性、干物质成分等与大棚中种植的石斛具有明显差异，其多糖成分所占比例也不同，由于林下仿生石斛中多糖组分含量较大，也预示着多糖类物质是林下仿生石斛发挥免疫调节作用的有效成分，具有重要的功能活性[15]。

本研究以环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠为动物模型，探究林下仿生石斛茎多糖对免疫抑制小鼠的淋巴器官发育的影响，为后续林下仿生石斛资源的综合利用以及开发具有免疫调节功效的功能性食品提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3年生林下仿生石斛：云南省普洱市斛哥庄园提供，为12月份采摘；SPF级C57BL/6J雄性6周龄小鼠40只，体重18 g～21 g：湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2019-0004。饲养于云南农业大学工程中心动物饲养室，饲养环境温度22℃～23℃，相对湿度60%～65%，自由饮水及进食。

IL-2（interleukin-2，IL-2）酶联免疫试剂盒、IL-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫试剂盒、IgM（immunoglobulin M，IgM）酶联免疫试剂盒、IgG（immunoglobulin G，IgG）酶联免疫试剂盒（96T）：江苏酶免实业有限公司；硫酸：重庆川东化工有限公司；苯酚：阿拉丁试剂（上海）有限公司；无水乙醇：天津市风船化学试剂科技有限公司；正己烷、正丁醇、三氯甲烷：庆川东化工有限公司；无水葡萄糖：广东光华科技股份有限公司；所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Epoch2波长酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；RM2135石蜡切片机：德国LeiCa公司；FA1004N分析天平：上海精密科学仪器有限公司；IUV-5100紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SC-36低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机：上海比郎仪器制造有限公司；DHG-9030烘箱：上海申贤鼓风干燥箱；YKP-700 C电子显微镜：上海永科光学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 仿生石斛多糖的提取粗纯化

林下仿生石斛多糖的提取主要参考本课题组前期优化的提取工艺[16]，称取林下仿生石斛粉末25.00 g，加入125.0 mL正己烷搅拌2 d后过滤、除去滤液，加入相同体积的95%乙醇26℃下搅拌2 d后过滤，滤渣自然风干。经过脱脂处理后的仿生石斛滤渣按照料液比1∶60（g/mL），在 95℃沸水中浸提，共提取 3次，过滤取滤液，进行旋转蒸发，浓缩至体积的1/5。

在浓缩后的多糖溶液中加入1/4体积的Sevage试剂（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1，体积比），混合振荡30 min。3 500 r/min离心5 min，除去水层和有机溶剂层的变性蛋白，重复操作7次～8次，直到变性蛋白层消失。

将脱除蛋白质的多糖溶液以每袋25.0 mL～30.0 mL的体积装入3 000 kD透析袋中，经反渗透水透析48 h，每隔3 h～4 h换1次水，然后将透析后的多糖溶液，以4倍体积95%乙醇的沉淀，4℃冰箱放置12 h，冷冻干燥后即得仿生石斛多糖（bionic dendrobium polysaccharide，BDP）。

1.3.2 仿生石斛多糖纯度及提取率测定

通过苯酚-硫酸法测定仿生石斛多糖纯度[17]，具体步骤如下。

精密吸取1.0 mg/mL葡萄糖标准品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 于 10.0 mL 具塞试管中，补水至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，振荡摇匀，加入5.0 mL浓硫酸，26℃放置10 min后30℃水浴20 min，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度y为纵坐标，对照品溶液浓度x为横坐标，绘制标准曲线。

准确量取仿生石斛多糖溶液1.0 mL于10.0 mL具塞试管中，加水至2.0 mL，按标准曲线的制备方法，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，振荡摇匀，加入5.0 mL浓硫酸，摇匀，26℃放置10 min后30℃水浴20 min，在490 nm波长处测定吸光度，通过标准曲线计算出供试品溶液中仿生石斛多糖浓度，仿生石斛多糖纯度及提取率计算公式如下。

式中：C为标准曲线上读出的多糖浓度，mg/mL；C母为样品浓度，0.1mg/mL；F为稀释倍数，100倍。

1.4 实验动物的分组与处理

C57BL/6J雄性小鼠适应性喂养7 d后随机分成4组，每组10只，分别为空白对照组（正常组）、免疫抑制模型组（模型组）、阳性对照组（左旋咪唑组）、仿生石斛多糖组。除空白对照组外，其余3组通过10 mg/mL的环磷酰胺溶液[母液为8.0 mL/（kg·d），溶于生理盐水]腹腔注射，每日1次，连续7 d，以构建免疫抑制小鼠模型。

1.5 小鼠脏器系数及外周免疫器官的收集及分析

构建免疫抑制模型成功后，将小鼠分为阳性对照组，灌胃10 mg/mL的左旋咪唑溶液[母液为4.0 mL/（kg·d），溶于生理盐水]，仿生石斛多糖组灌胃10 mg/mL仿生石斛多糖溶液[母液为12.0 mL/（kg·d），溶于生理盐水，该剂量为本课题小组前期实验探究最适浓度]，连续灌胃10 d，每日1次。空白对照组、模型组给予等体积的生理盐水[母液为13.3 mL/（kg·d）]，每天观察小鼠的活动指数（包括小鼠进食量、饮水量、毛发色泽、粪便性状，活动情况），每天记录1次小鼠体重变化、每3 d记录饮食饮水情况，同时更换小鼠垫料，保持饲养环境干燥整洁。末次给药后小鼠禁食12 h，对小鼠体重进行称量。颈椎脱臼处死后，取眼球外周血、小鼠胸腺、脾脏、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结，用0.9%NaCl溶液清洗，吸水纸吸干表面水分称湿重，计算肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结比重，以胸腺、脾脏的质量（g）与体重（g）的比值表示脏器系数。胸腺系数、脾脏系数、肠系膜淋巴结比重、腹股沟淋巴结比重的计算公式如下。

1.6 小鼠肠系膜淋巴结及肠道组织病理学形态分析

取出小鼠肠道及肠系膜淋巴结后在磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）溶液中冲洗干净，置于4%多聚甲醛液中，26℃固定1 d后，自来水冲洗4h～6h，进行浓度梯度酒精脱水，酒精浓度分别为45%、55%、65%、75%、85%、95%。将已融化的石蜡快速放置于包埋容器中，用镊子将样本小心放入包埋容器内，摆正位置，待蜡块凝固后；在切片机上进行切片，厚度为3 μm。切片置于65℃的烘箱中烤片1 h，使用二甲苯进行脱蜡，浸入65℃的二甲苯中15 min，取出后采用乙醇梯度水化，分别为乙醇二甲苯1 min、无水乙醇、95%、85%、75%、65%的乙醇各 1 min；纯水冲洗 1遍（约10 s），进行苏木精-伊红染色法（hematoxylin andeosin，HE）染色，中性树胶封片，26℃放置2 h，65℃烤片至树胶凝固（1h以上）。在电子显微镜下观察其组织形态并采集图片。

1.7 小鼠血清中细胞因子以及免疫球蛋白的含量检测

末次给药后禁食12 h，摘眼球取小鼠外周血，置于2.0 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，得各组小鼠血清样品，参考ELISA试剂盒说明书检测各组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6和免疫球蛋白IgG、IgM的水平。

1.8 数据处理

所有指标进行3次重复测定，采用Prism-Graph-Pad 6.0软件进行数据统计分析，采用One-Turkey分析各组间显著性差异。

2 结果与分析

2.1 仿生石斛多糖纯度及提取率的测定结果

图1为葡萄糖标准曲线。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

由图1可知，标准曲线回归方程y=10.939x+0.042，R2=0.999 6，计算得到仿生石斛多糖样品浓度，所得到的仿生石斛多糖纯度为85.58%。试验结果表明，25.00 g仿生石斛粉末可以提取1.70 g的冻干仿生石斛多糖粉，提取率为6.32%。

2.2 仿生石斛多糖对免疫抑制小鼠生理状态的影响

在饲养小鼠的24 d内，每天对小鼠的体重进行称量，每3 d对摄食、饮水情况进行统计，观察小鼠的毛发光泽及粪便色泽。不同饲养时间对小鼠的体重、摄食量以及饮水量进行统计分析的结果如图2所示。

图2 小鼠的体重、摄食量以及饮水量的变化Fig.2 Changes in body weight，food intake，and water consumption of the mice

由图2A可知，在环磷酰胺造模前，适应性喂养7 d内，小鼠的体重变化较为平稳，精神状态良好，无任何疾病指征。在第7天开始造模，造模后第3天开始，小鼠的体重逐渐下降，毛发光泽度变暗黄，活动指数下降，粪便呈暗暗的淡黄色，粪便表面变得粗糙，显示造模成功。由图2B、图2C可知，注射环磷酰胺后，模型组小鼠的摄食量与空白对照组相比明显降低，这可能主要是由于小鼠的肠道受损，使得饮水量以及摄食量降低。通过灌胃仿生石斛粗多糖3 d后，仿生石斛多糖组小鼠的饮水量相较于模型组明显提高158%，摄食量明显提高了142%，体重也逐渐开始恢复。这表明仿生石斛多糖可以有效缓解由环磷酰胺导致的小鼠机体的不适症状。

2.3 仿生石斛多糖对免疫抑制脾脏和胸腺指数的影响

不同饲喂条件下，小鼠的脾脏及胸腺指数如图3所示。

图3 小鼠的脾脏及胸腺指数变化Fig.3 Spleen and thymus index changes of mice

脾脏和胸腺是动物体内的主要免疫器官[18]，胸腺是机体T细胞产生的器官，对机体的细胞和体液免疫均具有重要影响。脾脏中含有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，与机体的非特异性免疫密切相关[19-20]。脾脏和胸腺系数的高低能够在一定程度上反映机体的非特异性免疫能力。因此对小鼠的脾脏、胸腺进行统计分析。由图3可知，实验小鼠注射环磷酰胺后，模型组小鼠相较空白对照组而言，脾脏指数高度显著降低（P＜0.001），胸腺指数极显著降低（P＜0.01），可见环磷酰胺使小鼠的免疫功能受到明显抑制，预示免疫抑制模型造模成功。介入仿生石斛多糖后，仿生石斛多糖组的脾脏指数为模型组的1.55倍，脾脏指数高度显著增加（P＜0.001）；胸腺指数极显著增加（P＜0.01），为模型组的2.01倍。结果表明，仿生石斛多糖可以促进小鼠淋巴器官的发育，对免疫抑制小鼠具有正向免疫调节作用。

2.4 仿生石斛多糖对免疫抑制小鼠腹股沟淋巴结的影响

不同饲喂条件下，小鼠的外周免疫器官腹股沟淋巴结的变化见图4、图5。

图4 小鼠的腹股沟淋巴结的表观图Fig.4 Apparent view of inguinal lymph nodes in mice

图5 各实验组小鼠的腹股沟淋巴结比重Fig.5 Proportion of inguinal lymph nodes in each experimental group

淋巴结是体内重要的外周免疫器官，它调节体液平衡，且参与免疫细胞运输，可以调节免疫应答[21]。腹股沟淋巴结主要收集下肢、会阴、外生殖器、臀部和腹前壁脐以下区域的免疫信息，并作出相应的免疫应答。由图4可知，实验小鼠注射环磷酰胺后，模型组小鼠的腹股沟淋巴结几乎看不到，这主要是由于环磷酰胺对于小鼠的周身免疫有一定的抑制作用，导致淋巴结变小，表明免疫抑制模型造模成功。介入仿生石斛多糖后，小鼠外周免疫器官腹股沟淋巴结得到恢复，在解剖过程中可以明显观察到淋巴结的存在，表明仿生石斛多糖可以有效提高小鼠的外周免疫能力。由图5可知，通过称取腹股沟淋巴结的湿重，仿生石斛多糖组的腹股沟淋巴结的比重为模型组的2.71倍，与模型组相比高度显著增强（P＜0.001），结果表明，仿生石斛多糖可以促进小鼠淋巴器官的发育，对免疫抑制小鼠的周身免疫有正向调节作用。

2.5 仿生石斛多糖对免疫抑制小鼠肠道及其肠系膜淋巴结的影响

不同实验条件下，各实验组小鼠的空肠肠道组织病理学变化见图6，肠系膜淋巴结组织病理学变化见图7。

图6 小鼠空肠组织病理学分析、绒毛长度与隐窝深度的比值及肠黏膜厚度变化Fig.6 Histopathological analysis of jejunum，ratio of villi length to crypt depth，and changes in intestinal mucosal thickness of mice

图7 小鼠空肠肠系膜淋巴结病理学分析及比重变化Fig.7 Histopathological analysis of mesenteric lymph nodes in the jejunum and changes in specific gravity of mice

隐窝为肠壁的凹陷，绒毛为肠壁的凸起，隐窝深度增加会减弱营养物质的吸收能力，绒毛高度增加会提高营养物质的吸收能力[22]，因此，绒毛高度与隐窝深度比值越大，肠道吸收能力越强。处死小鼠后，对肠道黏膜层厚度、绒毛高度与隐窝深度比值、肠系膜淋巴结病理学及比重进行统计分析。由图6A可知，空白对照组小鼠肠道绒毛排列整齐、紧密，模型组小鼠肠道绒毛变短，还发生碎裂。通过灌胃仿生石斛多糖后，小鼠的绒毛变得整齐致密，逐渐恢复至空白对照组水平。由图6B可知，仿生石斛多糖组其绒毛高度与隐窝深度比值高度显著大于模型组（P＜0.001），是模型组的1.64倍。由图6C可知，仿生石斛多糖组肠道黏膜层厚度大于模型组，为模型组的1.62倍，差异极显著（P＜0.01）。

肠道中存在多种淋巴组织，其中包含派氏集合淋巴结（peyerpatch，PP）结和肠系膜淋巴结。PP结是肠黏膜免疫系统的重要组成部分，是小肠壁黏膜内的一组淋巴滤泡，是T细胞和B细胞发生免疫应答的主要场所之一[23]。肠系膜淋巴结位于肠道系膜内，是肠道免疫细胞聚集和免疫应答的发生场所，肠系膜淋巴结可以直接反映肠道免疫调节的能力[24]。由图7A可知，空白对照组小鼠淋巴结组织结构完整，淋巴滤泡发育完全，细胞排列紧密有序。与空白对照组相比，环磷酰胺使肠系膜淋巴结的长度缩短，淋巴结组织结构破损，皮质区和髓质区及淋巴滤泡分区不明显，没有清晰的淋巴滤泡，不能很好区分淋巴细胞的分布，细胞排列涣散，淋巴细胞数量少。通过对图7B分析可知，介入仿生石斛多糖后，小鼠肠系膜淋巴结比重与模型组相比显著增加，也改善了肠系膜淋巴结组织的发育状况，计算可知仿生石斛组肠系膜淋巴结比重为模型组的1.55倍，长度为1.67倍，相较于模型组，差异高度显著（P＜0.001）。表明仿生石斛多糖对小鼠的肠道免疫功能具有一定的调节作用，能够在一定程度上改善由环磷酰胺诱导的免疫抑制性小鼠肠系膜淋巴结的组织损伤。

2.6 仿生石斛多糖对免疫抑制小鼠血清中分泌细胞因子水平的影响

不同实验条件下，各实验组小鼠细胞因子分泌情况如图8所示。

图8 小鼠血清中IL-2、IL-6的分泌水平变化Fig.8 Changes in the secretion levels of IL-2 and IL-6 in mice

细胞因子是调节免疫反应的重要靶点，白细胞介素2（IL-2）主要由活化的Th1细胞产生，对T细胞的增殖以及效应细胞和记忆细胞的产生有重要作用，有助于细胞免疫应答的产生[25]。白细胞介素6（IL-6）是一种用于维持体内平衡的细胞因子，通过激活Th2细胞来激活免疫应答，具有激活体液免疫的功能[26]。由图8A可知，建模后小鼠血清中的细胞因子IL-2的分泌水平与空白对照组相比高度显著降低（P＜0.001），介入仿生石斛多糖后，血清中的细胞因子IL-2开始增加，其中仿生石斛多糖组IL-2水平为模型组的1.47倍，这表明仿生石斛多糖可以刺激血清中细胞因子IL-2的分泌来调节小鼠的免疫，由图8B可知，腹腔注射环磷酰胺后，血清中的IL-6分泌水平相较于空白对照组高度显著降低（P＜0.001），仿生石斛多糖可以明显提高小鼠血清中IL-6的分泌水平，其水平为模型组的1.76倍，与模型组有极显著差异（P＜0.01）。说明仿生石斛多糖有助于恢复小鼠血清中IL-2、IL-6水平，且与阳性对照药物左旋咪唑效果相当。表明仿生石斛多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的恢复具有积极作用。

2.7 仿生石斛多糖对免疫抑制小鼠血清中分泌免疫球蛋白水平的影响

不同饲喂实验条件下，各实验组小鼠血清中免疫球蛋白的分泌水平情况如图9所示。

图9 小鼠血清中IgM和IgG的分泌水平Fig.9 Changes in the secretion levels of IgM and IgG in mice

免疫球蛋白具有免疫调节的作用，是机体发生体液免疫功能的重要组成部分，在调节免疫方面起到重要作用[27]。疫苗或外源性抗原刺激机体多产生IgG属性免疫球蛋白，IgM是机体内的保护性抗体，其浓度可作为机体感染的早期诊断[28]。通过检测血清中IgG及IgM含量情况，可以查看小鼠免疫机能的恢复状况。由图9可知，与模型组对比，给予仿生石斛多糖后，血清中IgG显著上调（P＜0.05），血清中IgM含量极显著上调（P＜0.01）。其中，仿生石斛多糖组IgG水平为模型组1.52倍，IgM含量为模型组1.45倍。表明仿生石斛多糖对于血清中免疫球蛋白水平的调节具有积极的作用，仿生石斛多糖对免疫抑制小鼠机体免疫机能的恢复具有积极作用。

3 结论

研究表明林下仿生石斛多糖可明显增强由环磷酰胺所导致的免疫抑制小鼠的免疫调节功能。明确了林下仿生石斛中的多糖可以显著提高血清中免疫球蛋白水平（P＜0.05），调节血清中细胞因子IL-2和IL-6的分泌水平以促进机体淋巴细胞增殖，刺激B细胞产生抗体，来激活机体非特异应免疫应答，提高机体免疫功能。通过测量肠道黏膜层厚度、绒毛高度与隐窝深度比值、肠系膜淋巴结比重，以及对肠道免疫系统的病理学形态进行观察，探讨了仿生石斛多糖对肠道免疫功能的正向调节功能，为后续肠道黏膜免疫的研究奠定了基础。但是机体免疫系统是一个极其复杂的系统，目前针对仿生石斛各组分独立的免疫调节机制以及各组分之间的相互影响作用仍有待深入研究。