红芪多糖对糖尿病胃轻瘫大鼠氧化应激的影响

郭倩，李雅琪，万生芳，魏昭晖，杨蕤，李荣科，张磊，舒畅，李亚玲，杨雅丽

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.中国药科大学，江苏 南京211298

糖尿病胃轻瘫（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常见的慢性消化道并发症之一，随着糖尿病发病率不断提高，DGP发病率占比达60%以上[1]。其主要表现是胃动力障碍、胃排空延迟、无机械性阻塞，并伴有餐后饱腹、恶心、呕吐等症状[2]。DGP发病机制复杂多变，与自主神经病变、胃肠激素紊乱、胃组织病变、氧化应激、高血糖等密切相关[3]。目前研究大多关注高血糖、自主神经病变等，从氧化应激方面研究DGP较少。氧化应激失衡是导致DGP的重要机制，多种植物多糖能改善氧化损伤，恢复氧化平衡[4]。红芪是甘肃道地药材，其主要活性成分红芪多糖（hedysarum polybotrys polysacchcaide）具有调节细胞免疫、抗氧化、抗炎、防治糖尿病等作用[5-8]。研究表明，红芪多糖能清除氧自由基，激活核因子E2相关因子（Nrf2）信号通路，促进抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）生成，减少诱导型一氧化氮合酶含量[6]。本课题组前期研究发现，红芪多糖能降低DGP大鼠血糖，提高胃肠动力，修复胃肠黏膜，抑制胃窦组织平滑肌细胞凋亡[6，9]。本实验观察红芪多糖对DGP大鼠胃排空率、小肠推进率的影响，并检测血清和小肠组织氧化应激相关指标变化，进一步探讨红芪多糖改善DGP的作用机制，为治疗DGP提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

72 只SPF 级6 周龄雄性Wistar 大鼠，体质量（180±20）g，北京斯贝福生物科技有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2019-0010。饲养于甘肃中医药大学动物房，温度23 ℃，相对湿度50%。本实验经甘肃中医药大学实验动物中心动物伦理委员会审批（2020-041）。

1.2 药物

红芪多糖，宝鸡市方晟生物开发公司，纯度72.4%，批号20200315。临用前用纯净水溶解，制成浓度分别为20、10、5 mg/mL溶液。枸橼酸莫沙必利分散片，成都康弘药业集团股份有限公司，5 mg/片，批号190614。将药品粉碎，用纯净水溶解，制成浓度为0.35 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

水合氯醛（天津市大茂化学试剂厂，批号20190504），血糖试纸（罗氏血糖健康医护公司，批号478696），链脲佐菌素（STZ，德国VETEC公司，批号WXBD4971V），活性氧（ROS）试剂盒（江苏酶标生物，批号MB-6608A），SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、8-羟基脱氧鸟苷酸（8-OHdG）、丙二醛（MDA）试剂盒（上海酶联生物，批号分别为ml059387、ml097316、ml028318、ml077384），PCR试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号G3321），中性树胶（北京索莱宝科技有限公司，批号G8590），伊红（北京索莱宝科技有限公司，批号G1100），苏木素（北京索莱宝科技有限公司，批号G1080），4%组织细胞固定液（北京索莱宝科技有限公司，批号P1110），谷胱甘肽转移酶（GST）、醌氧化还原酶1（NQO1）抗体（英国Abcam公司，批号分别为ab13849、ab80588），RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号R0010-100），Super ECL Plus超敏发光液（北京普利莱基因科技有限公司，批号P10100）。Accu-Chek Performa血糖仪（罗氏卓越金采），XYJ80-2电动离心机（常州市金坛恒丰仪器厂），Infinite M200 Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan），Varioskan Lux型实时定量PCR 仪（美国Thermo 公司），RM2016 切片机（德国LEICA），SHA-C 水浴锅（江苏荣华公司），IX51显微镜（日本OLYMPUS），ML408生物电放大器（上海ADInstruments），PL3508生理信号采集系统（上海ADInstruments），AUW220D 半微量电子天平（日本岛津公司），FRESCO 21高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模、分组及给药

将STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 4.2～4.5），配制成1%STZ溶液。72只大鼠适应性饲养1周后，随机分为空白组12只和造模组60只，禁食24 h，禁水2 h，造模组按50 mg/kg一次性腹腔注射STZ溶液，空白组注射等体积0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾静脉采血，测定随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠。造模组大鼠继续以高糖高脂饲料不规则喂养（单日上午进食，双日下午进食）4周，测定血糖≥16.7 mmol/L，并伴有饮水量增加、腹部胀大、体质量明显减轻等表现，随机抽取空白组与造模组大鼠各2只检测小肠肌电活动，造模组大鼠小肠自主收缩频率显著降低提示DGP大鼠造模成功。根据实际成模大鼠数量并综合考虑模型大鼠死亡率，最终模型组8只，阳性药组和红芪多糖高、中、低剂量组各9只。根据体表面积法及红芪多糖纯度计算等效剂量，阳性药组灌胃枸橼酸莫沙必利溶液3.5 mg/kg，红芪多糖高、中、低剂量组分别按200、100、50 mg/kg灌胃红芪多糖溶液，空白组和模型组予纯净水灌胃，灌胃体积均为2 mL，每日1次，连续8周。给药期间空白组予普通饲料喂养，其余各组继续高糖高脂饲料喂养。

1.5 检测指标

1.5.1 一般状况

观察大鼠精神状态、活动状况、毛色等，记录大鼠每日饮食量、饮水量变化，每2周测量体质量及尾静脉采血检测随机血糖。

1.5.2 胃排空率检测

检测前大鼠禁食24 h，禁水2 h，予50 mg/dL酚红溶液2 mL 灌胃，20 min 后10%水合氯醛腹腔注射（0.33 mL/100 g）麻醉，剖腹，结扎贲门和幽门，取出完整胃体，沿胃大弯剪开，用生理盐水冲洗胃内容物，定容至20 mL。加入0.5 mol/L氢氧化钠20 mL搅拌均匀，室温静置1 h，取上清液5 mL，加入20%三氯乙酸溶液0.5 mL去除蛋白，3 500 r/min离心15 min，取上清液。另取酚红溶液2 mL，依次加入生理盐水18 mL、20%氢氧化钠20 mL、三氯乙酸溶液4 mL搅拌均匀，作为酚红标准品。多功能酶标仪波长560 nm 处测定OD值，计算胃排空率。胃排空率（%）=（酚红标准品OD值-样品OD值）×100%。

1.5.3 小肠推进率检测

从幽门处分离小肠，平铺于冰面，于酚红染色末端剪一小口，滴加少量氢氧化钠，若变紫蓝色则为酚红到达部位，并在此区域前后分别滴加氢氧化钠以判断酚红实际到达位置，测量幽门至酚红到达部位长度及小肠全长（幽门至回盲瓣），计算小肠推进率。小肠推进率（%）=幽门至酚红到达部位长度÷小肠全长×100%。

1.5.4 ELISA检测

心脏采血后常温静置2 h，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，采用ELISA 检测血清ROS、SOD、GSH-Px、MDA、8-OHdG含量。

1.5.5 HE染色

取小肠组织，放入固定液中固定，脱水，透明，常规石蜡包埋，切片（厚度5 μm），二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min 脱蜡，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、90%、85%、75%乙醇各2 min复水，自来水冲洗，蒸馏水浸泡5 min，苏木素染色5 min，流水冲洗2 min，1%盐酸乙醇分化2 s，水洗返蓝，0.5%伊红染色1 min，水洗2 min，75%、85%、90%、95%乙醇各5 s，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各30 s。中性树胶封片，显微镜下观察。

1.5.6 qRT-PCR检测

称取大鼠小肠组织0.1 g置于无酶EP管中，加入1 mL Trizol，于冰上匀浆裂解，静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心8 min，将上清液转移至新的EP管中，加入0.2 mL 氯仿震荡摇匀，冰上静置3 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；吸取上清液，加入0.5 mL异丙醇，冰上静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；弃上清液，沉淀加1 mL 75%乙醇溶解，充分混匀，4 ℃、7 500 r/min离心5 min；弃上清液，沉淀即为总RNA，核酸定量分析仪测定RNA浓度。以RNA为模板反转录合成cDNA。RT-PCR 条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性0.05 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。95 ℃延伸15 s，60 ℃、1 h，95 ℃、15 s。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物由碧云天生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.7 Western blot检测

取小肠组织约100 mg，加入1 mL RIPA 裂解液，冰上充分研磨，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度；加入5×上样缓冲液充分混匀，100 ℃水浴加热10 min；蛋白上样，SDS-PAGE分离蛋白，冰浴、200 mA 转膜60 min，将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗涤3次，滴加GST、NQO1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；取出条带，TBST清洗3次，滴加二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，ECL发光液显影，凝胶成像分析仪摄取图像，采用Image J 1.4.8软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度值比值计算蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。实验数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红芪多糖对模型大鼠一般状况的影响

空白组大鼠饮食、饮水正常，精神状态佳，毛色光泽，反应敏捷；模型组大鼠造模初期出现多饮、多食、多尿，随机血糖升高，继而出现反应迟缓、毛色黯淡、精神萎靡、多饮多尿、进食量减少、腹部胀大。

与空白组比较，模型组大鼠各时点随机血糖显著升高（P<0.01）；与模型组比较，红芪多糖各剂量组和阳性药组大鼠给药6、8 周随机血糖显著降低（P<0.01）。见表2。

表2 各组大鼠随机血糖比较（，mmol/L）

表2 各组大鼠随机血糖比较（，mmol/L）

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01

与空白组比较，模型组大鼠各时点体质量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，给药4周后，红芪多糖高、中剂量组和阳性药组大鼠体质量显著升高（P<0.01），给药6、8周后，红芪多糖各剂量组和阳性药组大鼠体质量显著升高（P<0.01）。见表3。

表3 各组大鼠体质量比较（，g）

表3 各组大鼠体质量比较（，g）

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01

2.2 红芪多糖对模型大鼠胃排空率及小肠推进率的影响

与空白组比较，模型组大鼠胃排空率和小肠推进率显著降低（P<0.01）；与模型组比较，红芪多糖高、中剂量组和阳性药组大鼠胃排空率和小肠推进率显著升高（P<0.01）；与阳性药组比较，红芪多糖中、低剂量组大鼠胃排空率和小肠推进率显著降低（P<0.01）。见表4。

表4 各组大鼠胃排空率及小肠推进率比较（，%）

表4 各组大鼠胃排空率及小肠推进率比较（，%）

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01；与阳性药组比较，△△P<0.01

2.3 红芪多糖对模型大鼠血清活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和8-羟基脱氧鸟苷酸含量影响

与空白组比较，模型组大鼠血清ROS、MDA、8-OHdG含量显著增加（P<0.05，P<0.01），SOD含量显著减少（P<0.01）；与模型组比较，红芪多糖高剂量组和阳性药组大鼠血清ROS、MDA、8-OHdG含量显著减少（P<0.05，P<0.01），SOD 含量显著增加（P<0.05，P<0.01）。各组大鼠血清GSH-Px含量差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

表5 各组大鼠血清ROS、SOD、GSH-Px、MDA、8-OHdG含量比较（）

表5 各组大鼠血清ROS、SOD、GSH-Px、MDA、8-OHdG含量比较（）

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4 红芪多糖对模型大鼠小肠组织病理变化的影响

空白组大鼠小肠组织结构完整，肠黏膜正常，腺体结构清晰，无炎性细胞浸润；模型组大鼠小肠组织结构模糊，腺体结构被破坏，黏膜消失，有大量炎性细胞浸润；各给药组大鼠小肠组织损伤情况有所好转，炎性细胞浸润减少，以红芪多糖高剂量组作用更明显。结果见图1。

图1 各组大鼠小肠组织形态（HE染色，标尺=100 μm）

2.5 红芪多糖对模型大鼠小肠组织Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1、核因子E2 相关因子、血红素加氧酶-1和硫氧还蛋白mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠小肠组织Keap1 mRNA表达显著升高，Nrf2、HO-1、Trx mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，红芪多糖高剂量组和阳性药组大鼠小肠组织Keap1 mRNA表达显著降低，Nrf2、HO-1、Trx mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表6。

表6 各组大鼠小肠组织Keap1、Nrf2、HO-1、Trx mRNA表达比较（）

表6 各组大鼠小肠组织Keap1、Nrf2、HO-1、Trx mRNA表达比较（）

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.6 红芪多糖模型大鼠小肠组织GST 和NQO1 蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠小肠组织GST 和NQO1蛋白表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，红芪多糖高剂量组和阳性药组大鼠小肠组织GST 和NQO1蛋白表达显著升高（P<0.01）。见表7、图2。

图2 各组大鼠小肠组织GST和NQO1蛋白免疫印迹

表7 各组大鼠小肠组织GST、NQO1蛋白表达比较（）

表7 各组大鼠小肠组织GST、NQO1蛋白表达比较（）

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01

3 讨论

Keap1/Nrf2信号通路是抗氧化应激的经典通路，Keap1是氧化还原反应的传感器，正常情况下，Keap1主要与Nrf2结合，以非活性状态存在于胞浆中，当受到ROS等刺激后，通过使构象发生改变从而与Nrf2解偶联，使Nrf2转入细胞核内与Maf蛋白结合成异质二聚体后与抗氧化反应元件结合，激活Ⅱ相代谢酶、抗氧化酶或药物转运体的转录活性，发挥抗氧化损伤作用，恢复细胞内稳态[10]。Keap1/Nrf2信号通路被激活后，进一步启动下游关键靶标如HO-1、Trx、NQO1、GST、SOD、GSH-Px、8-OHdG等，增强机体氧化应激反应，维持氧化平衡。

Keap1是氧化应激的关键蛋白，能提高机体对心肌微血管内皮细胞的保护作用，协调氧化应激，缓解机体氧化损伤[11]。GST是体内二相代谢酶，能促进氧化应激产物与还原型谷胱甘肽结合，维持氧化还原动态平衡，是抗氧化系统的重要组成部分，参与脂肪蛋白的生物合成，保护细胞免受化学和代谢损伤及氧化应激反应，调节脂质、能量代谢[12-13]。研究表明，GST含量变化是引起氧化应激、胰岛素抵抗等内环境紊乱的关键因素，更是导致2型糖尿病及其并发症的关键因素[14]。NQO1是细胞质中调节氧化还原反应的蛋白酶，能解除自由基和化合物毒性，是Nrf2下游重要的抗氧化因子，通过清除ROS催化体内还原反应，保护细胞免受氧化应激损伤[15]。研究发现，增强Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达可改善氧化应激，从而达到改善糖尿病并发症的目的[16]。

本实验中模型组大鼠小肠组织Keap1 mRNA表达显著升高，Nrf2、HO-1、Trx mRNA 表达显著降低，血清ROS、MDA、8-OHdG含量显著增加，SOD含量显著减少，胃排空率和小肠推进率显著降低，提示模型大鼠出现氧化应激损伤。经药物干预后，阳性药组和红芪多糖高、中剂量组大鼠小肠组织Keap1 mRNA表达显著降低，Nrf2、HO-1、Trx mRNA表达显著升高，血清ROS、MDA、8-OHdG含量显著减少，SOD含量显著增加，胃排空率和小肠推进率显著升高，提示机体抗氧化应激能力明显改善。

综上所述，红芪多糖干预能改善DGP大鼠一般状况，提高胃排空率和小肠推进率，调节血清ROS、MDA、8-OHdG、SOD含量，改善小肠组织病理损伤，其机制与下调小肠组织Keap1 mRNA表达，上调Nrf2、HO-1、Trx mRNA及GST、NQO1蛋白表达有关。本研究从抗氧化应激角度揭示了红芪多糖改善DGP的作用机制，可为相关临床研究提供实验依据。