泽漆化痰方对慢性阻塞性肺疾病气道黏液高分泌大鼠肠道EGFR-MUC2信号通路相关因子的影响

沈书扬，高阳，王传旭，傅慧婷

上海中医药大学附属曙光医院，上海201203

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以慢性支气管炎、肺气肿为主要病理基础的慢性疾病，主要表现为持续的呼吸系统功能异常和通气受限[1]。气道黏液高分泌是促进COPD病情发展的关键因素，有效抑制气道黏液高分泌是治疗气道炎性病变的关键[2]。气道黏液高分泌与表皮生长因子受体（EGFR）信号通路密切相关，EGFRSP1通路和EGFR-ERK1/2通路可同时调控气道黏蛋白（MUC）5AC和肠道MUC2表达，通过豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物（MARCKS）介导的胞吐作用引起气道黏液高分泌[3-6]。

大肠与肺都源于原肠胚的内胚层，结构上具有相似性，且两者在生理病理上相互影响，由此产生“肠-肺轴”的概念[7]，与“肺与大肠相表里”的中医理论吻合。泽漆化痰方是上海中医药大学黄吉赓教授治疗痰饮经验方，全方升降并举，调理气机，外透内散，使肺气宣降，水道通调，而痰饮自消[8]。前期研究发现，泽漆化痰方可通过调控肺部EGFR介导的炎症信号通路抑制气道黏液分泌[9-11]。基于此，本研究通过建立COPD气道黏液高分泌大鼠模型，观察泽漆化痰方对模型大鼠肠道炎症反应的影响，从调控肠道炎症角度探讨其治疗COPD的作用机制，为COPD的中医治疗提供依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性Wistar大鼠48只，6～8周龄，体质量200～220 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养于上海中医药大学实验动物中心，温度22～23 ℃，湿度55%～60%，12 h光照。实验操作严格遵守《中华人民共和国实验动物管理条例》相关规定，并经上海中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（PZSHUTCM210903016）。

1.2 药物及制备

泽漆化痰方（泽漆30 g，柴胡15 g，竹沥半夏15 g，紫菀15 g，款冬花15 g，白前12 g，前胡12 g，桔梗9 g，枳壳9 g，陈皮9 g，甘草9 g），饮片由上海中医药大学附属曙光医院提供，常规煎煮，浓缩至原药材浓度为3.2 g/mL。AG1478，美国Calbiochem公司，货号ICG1024，加入适量DMSO助溶，超声振荡混匀，配制成浓度为1 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

EGFR 抗体，英国Abcam 公司，货号ab52894；p-EGFR抗体，美国CST公司，货号3777；MUC2抗体（分别用于Western blot和免疫荧光），英国Abcam公司、美国Thermo Fisher Scientific公司，货号分别为ab272692、PA5- 103083；肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA试剂盒、白细胞介素（IL）-10 ELISA试剂盒、IL-13 ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，货号分别为ml002859、ml002813、ml 003012；脂多糖（LPS），英国Sigma 公司，货号L2880。冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号5415R），摊片机（浙江科迪仪器有限公司，型号KD-H），切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016），包埋机（浙江科迪仪器有限公司，型号KD-BL），电泳及转膜仪（美国Bio-Rad 公司，型号170-4070），全功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号MK3），紫外分光光度计（上海美析仪器有限公司，型号UV-1800PC）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

48只大鼠随机分为空白组、模型组、AG1478组和泽漆化痰方低、中、高剂量组，每组8只。除空白组外，其余各组进行造模，造模周期28 d。第1、14日，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，用5 g/L LPS进行气道滴注，滴注量50 μL；剩余时间将大前门牌香烟点燃后放入装有大鼠的烟熏箱内烟熏1 h，每日2 次（上午8:30、下午1:30），每次15支。造模第14日开始，泽漆化痰方低、中、高剂量组分别予泽漆化痰方汤剂16、32、64 g/kg灌胃，AG1478组予AG1478溶液10 mg/kg灌胃，给药时间每日上午8:00，空白组及模型组予等量生理盐水灌胃，连续14 d。

2.2 取材

给药结束后次日取材，取材前大鼠禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，剪去腹部毛发，切开腹部，取大肠组织横结肠段，一部分用4%甲醛溶液固定，用于免疫荧光染色，另一部分置于-80 ℃冷冻保存，用于蛋白检测。取降结肠段，分3次注入10 mL PBS，反复吹打后将肠黏液转移至15 mL离心管，用于ELISA检测。打开胸部，取右肺组织，4%甲醛溶液固定，用于病理观察。

2.3 病理观察

取大鼠右肺组织，4%甲醛固定，梯度乙醇脱水，浸蜡，包埋，切片，烤片，脱蜡后行PAS染色，中性树脂封片，光镜下观察大鼠肺组织病理形态。

2.4 ELISA检测

肠黏液4 ℃、5 000 r/min离心15 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书步骤操作，酶标仪波长450 nm处测量OD值，根据标准曲线计算样品TNF-α、IL-13、IL-10含量。

2.5 Western blot检测

RIPA法裂解结肠组织提取总蛋白，BCA法蛋白定量，电泳，转膜，封闭，加入EGFR一抗（1∶1 000）、p-EGFR 一抗（1∶500）、MUC2 一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。1×TBST漂洗，加入HRP标记山羊抗兔IgG（1∶1 000），室温振摇孵育1 h，1×TBST漂洗，ECL化学发光法显影，计算目的蛋白相对表达量。

2.6 免疫荧光检测

结肠组织石蜡切片脱蜡，抗原修复，1%BSA封闭，加入1%BSA 稀释的p-EGFR 一抗（1∶800）、MUC2一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜，加入荧光二抗（1∶500），避光孵育1 h，DAPI复染，中性树脂封片，计算阳性表达面积比。

3 统计学方法

4 结果

4.1 泽漆化痰方对模型大鼠肺组织病理形态的影响

空白组大鼠气道黏膜上皮完整，杯状细胞少见，黏膜下腺体无异常增生，气道壁厚度正常，气道通畅，腔内无分泌物阻塞；模型组大鼠可见气道上皮纤毛脱落，杯状细胞数目显著增多，黏膜下腺体肥大增生，表明模型制备成功；泽漆化痰方各剂量组和AG1478组大鼠杯状细胞数目减少，黏膜下腺体增生减轻，上皮脱落坏死程度改善，其中泽漆化痰高剂量组最显著。见图1。

图1 各组大鼠肺组织形态（PAS染色，×400）

4.2 泽漆化痰方对模型大鼠肠黏液炎症因子含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠肠黏液TNF-α、IL-13含量显著增加（P<0.05），IL-10 含量显著减少（P<0.05）；与模型组比较，泽漆化痰方低、中、高剂量组和AG1478组大鼠肠黏液TNF-α、IL-13含量显著减少（P<0.05），IL-10含量显著增加（P<0.05）；与AG1478组比较，泽漆化痰方中、高剂量组大鼠肠黏液IL-13含量显著减少（P<0.05），IL-10 含量显著增加（P<0.05）；与泽漆化痰方低剂量组比较，泽漆化痰方中、高剂量组大鼠肠黏液TNF-α、IL-13含量显著降低（P<0.05），IL-10含量显著增加（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肠黏液TNF-α、IL-13、IL-10含量比较（，pg/mL）

表1 各组大鼠肠黏液TNF-α、IL-13、IL-10含量比较（，pg/mL）

注：与空白组比较，*P<0.05；模型组比较，#P<0.05；与AG1478组比较，△P<0.05；与泽漆化痰方低剂量组比较，▲P<0.05；与泽漆化痰方中剂量组比较，□P<0.05

4.3 泽漆化痰方对模型大鼠结肠组织表皮生长因子受体、黏蛋白2蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与空白组比较，模型组大鼠结肠组织p-EGFR、MUC2蛋白表达显著升高（P<0.05）；与模型组比较，泽漆化痰方各剂量组大鼠结肠组织p-EGFR、MUC2 蛋白表达显著降低（P<0.05），AG1478组p-EGFR蛋白表达显著降低（P<0.05）；与AG1478组比较，泽漆化痰方各剂量组大鼠结肠组织MUC2蛋白表达显著降低（P<0.05）；与泽漆化痰方低剂量组比较，泽漆化痰方中、高剂量组大鼠结肠组织MUC2蛋白表达显著降低（P<0.05）。见图2、表2。

表2 各组大鼠结肠组织p-EGFR、MUC2蛋白表达比较（，相对灰度值）

表2 各组大鼠结肠组织p-EGFR、MUC2蛋白表达比较（，相对灰度值）

注：与空白组比较，*P<0.05；模型组比较，#P<0.05；与AG1478组比较，△P<0.05；与泽漆化痰方低剂量组比较，▲P<0.05

图2 各组大鼠结肠组织p-EGFR、EGFR、MUC2蛋白免疫印迹

免疫荧光染色结果显示，与空白组比较，模型组大鼠结肠组织p-EGFR、MUC2阳性表达显著升高（P<0.05）；与模型组比较，泽漆化痰方各剂量组和AG1478 组大鼠结肠组织p-EGFR 阳性表达显著降低（P<0.05），泽漆化痰方中、高剂量组大鼠结肠组织MUC2阳性表达显著降低（P<0.05）；与AG1478组比较，泽漆化痰方高剂量组大鼠结肠组织MUC2阳性表达显著降低（P<0.05）；与泽漆化痰方低剂量组比较，泽漆化痰方中、高剂量组大鼠结肠组织MUC2阳性表达显著降低（P<0.05）。见图3、图4、表3。

表3 各组大鼠结肠组织p-EGFR、MUC2蛋白表达比较（，阳性面积比）

表3 各组大鼠结肠组织p-EGFR、MUC2蛋白表达比较（，阳性面积比）

注：与空白组比较，*P<0.05；模型组比较，#P<0.05；与AG1478组比较，△P<0.05；与泽漆化痰方低剂量组比较，▲P<0.05

图3 各组大鼠结肠组织p-EGFR阳性表达（免疫荧光染色，×200）

图4 各组大鼠结肠组织MUC2蛋白阳性表达（免疫荧光染色，×200）

5 讨论

气道黏液高分泌表现为慢性咳嗽、咳痰，大量分泌的黏液聚集于气道管腔造成持续性气流受限，导致COPD患者呼吸道反复炎症，且其引发的阵发性咳嗽是COPD重要且独立的危险因素[12]。COPD动物模型建立包括单纯烟熏法、蛋白水解酶诱导法、内毒素诱导法、基因敲除等[13]，本研究最终确定以烟熏合并LPS气道内滴入的方法造模，因其病理改变与人类COPD特征更为接近，且所需时间较短。第28 日造模结束后，PAS染色可见大鼠肺部上皮纤毛脱落、杯状细胞增生、黏膜下腺体肥大，提示模型制备成功。给予泽漆化痰方治疗后，大鼠杯状细胞增生程度减轻、黏膜下腺体肥大改善、上皮脱落坏死程度改善，提示泽漆化痰方可通过抑制气道黏液分泌改善COPD症状。

模型组大鼠肠黏液TNF-α、IL-13含量增加，IL-10含量减少，结肠组织p-EGFR、MUC2 蛋白表达升高，提示肠道炎症水平加剧，EGFR 信号通路被激活。经泽漆化痰方治疗后，模型大鼠肠道炎症水平降低，EGFR信号通路激活减弱，且作用优于EGFR抑制剂AG1478。

根据症状，COPD 可归属中医学“肺胀”范畴，以痰浊为主要病因，呼吸道黏液过度分泌可归于“痰饮”，故COPD气道黏液高分泌与“肺胀”“痰饮”机制相合，因此应从“痰”论治[14]。泽漆化痰方选用苦寒之泽漆，因其善于泄水，以消痰饮；本病多为痰郁化热之证，故选用柴胡、竹沥半夏以清热透表、解郁散结、消痰除痞；因其多伴久嗽，故选用紫菀、款冬花祛痰止咳；前胡、白前均为治痰饮咳喘之要药，两药合用，以治新旧喘咳；桔梗、枳壳合用，行气解郁，使全身之气得顺，而水液得调。全方升降并施，以调理气机，使肺主宣降，水道得调，顽疾自愈。

综上所述，泽漆化痰方可抑制COPD大鼠气道黏液高分泌症状，抑制肠道炎症因子TNF-α、IL-13，促进IL-10分泌，其机制可能与调节肠道EGFR-MUC2信号通路有关。