动物源食品中抗生素残留检测方法与研究进展

付海燕,卢欢欢,龙婉君,佘远斌

1.中南民族大学 药学院,湖北 武汉 430074;2.浙江工业大学 化学工程学院,浙江 杭州 310014

0 引言

抗生素类药物具有抑制或杀灭微生物的作用,不仅可以预防和治疗人类及畜禽细菌感染等疾病,还可用作饲料添加剂[1],在畜牧业中得到广泛应用[2]。然而,有些不良商家为追求养殖利益滥用抗生素,造成畜禽体内抗生素残留超标。此外,畜禽自身仅能吸收少量的抗生素[3],30%～90%的抗生素会以母体或者代谢产物的形式被排入周围环境中,造成一定程度的环境污染[4]。无论是畜禽体内残留还是排入环境,抗生素最终都会经食物链直接或间接地进入人体,危害人类健康。抗生素在体内累积不仅可导致过敏反应、关节病变、胃肠道不适、肝和中枢神经损害等[5],还存在致畸、致癌、致突变等潜在风险。值得注意的是,若人体产生耐药性,会给相关疾病的治疗带来更大困难[6]。近年来,在肉类[7]、奶制品[8]、水体[9]中抗生素残留超标的情况屡见不鲜,面对这一严峻现状,我国农业农村部、国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局已多次发布公告和标准[10-13],针对食品中兽药最大残留限量及食品动物禁用抗生素种类均做了明确规定。目前,动物源食品中抗生素残留检测的研究越来越受到业界重视,但现有的检测方法存在分析时间较长、难以实现多种类型抗生素同时检测等问题。因此,开发快速且准确的抗生素检测方法对于保障食品安全至关重要。本文拟从动物源食品中抗生素的主要类型、残留现状、检测方法、检测难点等方面进行综述,以期为抗生素检测方法的开发及应用提供参考。

1 动物源食品中抗生素主要类型

1.1 氟喹诺酮类

氟喹诺酮类(Fluoroquinolones, FQs)抗生素是一类人畜通用抗生素,因含有喹诺酮结构而得名,具有抗菌谱广、抗菌效果好等优势,在医疗和养殖业中得到广泛应用。该类抗生素可以抑制细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶活性,从而起到杀菌作用[14]。FQs抗生素主要有氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星等,其中,诺氟沙星、环丙沙星和氧氟沙星的使用量可达98%[15]。然而,进入禽畜体内的FQs抗生素仅有30%可被吸收,大多残留物都会以原型或代谢物的形式被排出体外,最终进入到环境中[16]。人体长期摄入FQs抗生素会引发神经系统损伤,这主要是因为FQs抗生素可抑制脑内抑制性神经递质γ-氨基丁酸与受体结合,使中枢神经兴奋性增高,甚至导致痉挛和癫痫的发作[17]。

1.2 β-内酰胺类

β-内酰胺类(β-lactams, BLAs)抗生素的结构中均具有β-内酰胺基母核,是目前临床上使用最多的一类抗生素[18],主要包括青霉素类、头孢菌素类等。BLAs抗生素能抑制细菌黏肽转肽酶活性,阻断细菌细胞壁的合成,从而起到杀菌作用[19]。近年来,由于该类抗生素的滥用,导致环境中出现了大量的抗生素耐药菌和抗生素耐药基因(Antibiotic Resistance Genes,ARG)[20]。其中,ARG可以通过动物源性食品转移到人体内,对人类健康造成威胁[21]。此外,人体长期摄入BLAs抗生素会破坏肠道的正常菌群环境,导致人体免疫力降低。

1.3 大环内酯类

大环内酯类(Macrolides, MA)抗生素是一种含有2个脱氧糖分子和14～16个碳原子的大脂肪族内酯环碱性药物[22]。MA抗生素可以与细菌核糖体的50 S亚基发生不可逆结合,阻断转肽和mRNA的位移,从而有选择地抑制蛋白质的合成,起到杀菌作用[23]。常见的MA抗生素有红霉素、吉他霉素、阿奇霉素等,这类抗生素既可用作药物,也可作为生长促进剂用于提高养殖业经济效益[24]。目前,由于缺少有效的监管,导致MA抗生素滥用的情况十分普遍,而未被代谢的抗生素最终也会进入环境中[25]。人体长期摄入MA抗生素会过度刺激胃动素受体,对胃肠道产生副作用,从而引发腹部绞痛、恶心、呕吐、腹泻等症状[26]。

1.4 四环素类

四环素类(Tetracyclines, TCs)抗生素的主体母核为氢化骈四苯,取代基的种类决定了该类抗生素的种类。常见的TCs抗生素有土霉素、金霉素、多西环素等[27]。TCs抗生素是我国畜禽养殖业中使用较广泛的抗生素之一,具有廉价、高效、抗菌谱广等优点[28]。然而,TCs抗生素的累积及细菌耐药性的产生,会对人类健康产生潜在威胁。有研究[29-30]表明,过量服用TCs抗生素会产生毒副作用或引起相关疾病,如四环素牙、恶心呕吐、过敏反应等,其中以四环素牙较为常见,这主要是由于TCs抗生素进入人体后,易堆积于骨、牙齿和肝脏组织中,长期滞留在牙釉质及下层钙化区而将牙齿染黄。此外,过量TCs抗生素残留排入环境中会抑制环境微生物生长,对生态环境造成一定程度的破坏[31]。

1.5 硝基呋喃类

硝基呋喃类(Nitrofurans, NFs)抗生素是在呋喃核的5位引入硝基和2位引入其他基团而人工合成的抗菌药。常见的NFs抗生素有呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因等[32]。研究[33-34]表明,NFs抗生素中呋喃环5位上的硝基与致癌性密切相关,长期或者大剂量使用NFs抗生素会对人体产生较大的毒副作用,存在致癌、致畸和诱导基因突变的潜在风险。自1995年起,欧盟禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用[35]。2002年我国农业部及2020年农业农村部均发布公告,明令禁止NFs抗生素在所有食品动物饲料中的使用[10,36]。

1.6 磺胺类

磺胺类(Sulfonamides, SAs)抗生素是以对位氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物[37],具有成本低、抗菌谱广等优点,其生产和消费量呈逐年稳定增长趋势。然而,过度使用会导致残留的SAs抗生素通过多种途径进入环境中,据估计,每年有超过2×104t的SAs抗生素进入全球环境中[38]。在其他污染因素的联合作用下,SAs抗生素的生物降解会受到抑制,从而产生细菌耐药性并出现耐药基因[39]。当SAs抗生素进入人体后,其代谢产物会形成晶体,对人体泌尿系统造成损伤[40]。

1.7 酰胺醇类

酰胺醇类(Amphenicols)抗生素的化学结构中均含有二氯乙酰胺基团,常见的种类有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。该类抗生素的作用机制是与细菌70 S核糖体50 S亚基的A位点结合,抑制肽酰转移酶的转肽反应,阻止肽链延伸,从而抑制细菌蛋白质的合成[41]。其中,氯霉素因可能导致灰婴综合征、再生障碍性贫血等危害[42-43],已被我国禁止作为兽药使用[10]。

1.8 氨基糖苷类

氨基糖苷类(Aminoglycosides, AGs)抗生素是由氨基糖分子与氨基环醇通过醚键连接而成的苷类抗生素[44],主要包括天然来源的链霉素、卡那霉素等,以及半合成的阿米卡星、依替米星等。AGs抗生素的抗菌机制主要通过干扰细菌蛋白质合成而发挥作用[45]。该类抗生素具有较强的耳毒性、肾毒性,其中,耳毒性主要表现为对第8对脑神经、前庭神经和耳蜗神经造成损害;肾毒性主要表现为对肾小管上皮细胞造成损害[46]。长期摄入AGs抗生素超标的食物将对人体产生巨大危害[47]。

2 动物源食品中抗生素残留现状及危害

在养殖业中,抗生素类药物的不当使用会增加其在动物源食品中残留的风险,当残留的抗生素被人体摄入并累积,即使其质量浓度较低,也可能对人体健康产生负面影响[48]。因此,抗生素残留已成为全球关注的重要问题。

2.1 动物源食品中抗生素残留现状

抗生素不仅可以预防和治疗家禽疾病,还可用作饲料促进家禽生长。不良商家为赚取高额利益,在饲养家禽时滥用抗生素,导致动物源食品中抗生素残留超标问题时常发生。在全球范围内,常见肉类,例如鸡肉[49]、牛肉[50]、猪肉[51]、水产海鲜[52]等均存在较严重的抗生素残留现象。在黎巴嫩不同地区的鸡肉样本中筛查抗生素残留,发现至少77.5%的样本中存在抗生素残留污染,萨拉沙星、阿莫西林和青霉素G的残留水平均值均高于欧盟推荐的最大残留限量(Maximum Residue Limit,MRL)[53]。在中国东南部抽样10种淡水鱼进行65种抗生素残留的检测,发现抗生素总检出率为53.9%,其中3.48%的样品中抗生素残留超过MRL[54]。在我国长三角地区采集淡水养殖的3种水产品进行抗生素残留的检测,发现共有9种抗生素被检出,检出率为38.1%～90.5%,其中恩诺沙星和磺胺甲恶唑残留较严重[55]。此外,2016—2019年,在我国湖北省采集鸡肉和鸡蛋进行9种FQs抗生素、4种TCs类抗生素和甲硝唑残留的检测,发现鸡蛋中存在恩诺沙星、环丙沙星等抗生素,而鸡肉中检出了甲硝唑[56]。由此可见,目前动物源食品安全问题依然严峻,抗生素滥用造成的残留超标问题应当引起全社会的重视。

2.2 动物源食品中抗生素残留的危害

抗生素最常见的副作用之一是过敏反应。Q. WANG等[57-58]研究发现,青霉素可能会使皮肤产生过敏反应;TCs抗生素会导致过敏、皮疹和光毒性皮炎等特殊反应;MA抗生素可能使大环内酯代谢物修饰的肝细胞产生特异性过敏反应,导致肝损伤。近年来,耐药性已成为抗生素造成的严重危害之一。人体通过食物链摄入的抗生素残留可能会改变人体微生物菌群,促使人体耐药细菌的出现,使人体产生抗生素耐药性[59]。李振环等[60]研究表明,服用抗生素会使耐药细菌在人体内稳定存在并持续数年,即使使用低剂量的抗生素,也可能导致耐药性产生。目前,耐多药细菌已经造成诸多感染性疾病治疗困难,因此,抗生素耐药性已成为一个严峻的公共卫生问题,预计到2050年,全球由耐药性造成的死亡人数可能增至1000万人,造成的经济损失将达到100万亿美元[61]。

针对抗生素滥用这一严重问题,我国对一系列抗生素的使用进行了规范。2015年9月7日,我国农业部第2292号公告规定,禁止在食品动物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种抗生素[11]。此外,还对各动物组织中其他抗生素残留设定了MRL,例如,TCs抗生素的MRL为100～1200 μg/kg,红霉素的MRL为40～200 μg/kg,等等[13]。

3 动物源食品中抗生素残留检测方法

3.1 色谱法

3.1.1 高效液相色谱法高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法具有选择性好、分离效率高、适用面广等优点,在化学、医学、工业等多个学科领域中已经成为一种十分重要的分离和分析技术。在使用HPLC法对抗生素进行检测时,常用的流动相为乙腈[62]和磷酸盐溶液[63]。陈晓燕等[64]基于基质分散固相萃取-高效液相色谱-可变波长检测法测定了鲜牛乳中氯霉素、呋喃唑酮等8种抗生素的含量,其中磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的检出限低至0.18 μg/kg。

3.1.2 高效液相色谱-质谱联用技术高效液相色谱-质谱(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)联用技术具有灵敏度高、选择性好、检出限低等优点,是当前较为先进的抗生素残留检测方法[65]。我国农业部于2019年制定了采用LC-MS法检测水产品中MA抗生素(红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素等)残留的标准[66]。宫小明等[67]采用棉签固相微萃取结合HPLC-MS联用技术检测蜂蜜中9种MA抗生素,其中螺旋霉素的检出限低至0.24 μg/kg。

综上可知,色谱法准确性好、灵敏度高、检出限低,是目前国标规定的多种抗生素检测的主要方法。但色谱仪器较昂贵、操作较复杂、耗时较长,无法满足抗生素残留快速检测的需求。

3.2 光谱法

3.2.1 表面增强拉曼光谱法表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)法是一项新兴的快速检测技术,具有操作简便、检测速度快、准确率高等特点,已广泛应用于抗生素的灵敏检测。M.K.Jin等[68]提出了一种新颖、简便、绿色、灵敏的中空纤维液相微萃取-SERS (HF-LPME-SERS)技术,并应用于鸡蛋样品中多种抗生素残留的快速检测,发现优化后的HF-LPME方法可直接从鸡蛋样品中提取抗生素,对氧氟沙星、磺胺二甲嘧啶、四环素等11种抗生素的最低检出限为10 μg/kg。该方法的样品操作简便、成本低、灵敏度较高,可实现食品中痕量抗生素残留的快速检测。

3.2.2 三维荧光光谱法三维荧光光谱(Excitation-Emission-Matrix Spectra,EEMs)法具有简便快捷、灵敏度高等优点,当其与化学计量学二阶校正方法相结合时,借助二阶校正方法的“二阶优势”,能够在未知干扰存在时同时快速测定多个目标分析物。Y.Z.Ouyang等[69]建立了一种有效的化学计量学辅助分析策略,将EEMs与基于交替归一加权残差算法的二阶校正方法相结合,并应用于动物源食品样品(奶粉、牛奶和牛肉)中FQs抗生素的简单快速检测。与HPLC、LC-MS等复杂方法相比,该方法无需繁琐的前处理步骤、严格的实验条件和复杂的高成本仪器,可实现动物源食品基质中FQs抗生素快速、准确定量分析。

综上可知,光谱法检测时间短、样品预处理简单,但该方法的抗干扰能力较弱,而牛奶、奶粉、鸡蛋、肉制品、蜂蜜等动物源食品基质背景较复杂,存在许多未知干扰,因此,该方法尚无法满足市面上抗生素残留精准检测的需求。

3.3 电化学分析法

电化学分析(Electrochemical Analysis)法是基于电化学传感器产生的可测量电信号实现检测的方法[70],具有简单、灵敏度高、实施成本低等优点,是目前抗生素检测常用方法之一。H.S.Stevenson等[71]开发了一种基于亲和型电化学生物传感器,并将其用于肉类样品中头孢噻呋残留的无标签检测,发现该方法对头孢噻呋的检出限低至0.01 μg/L。此外,B.B.Zhou等[72]采用电聚合法制备了分子印迹电化学传感器,该方法可实现牛奶中呋喃西林高特异性、高灵敏度的快速检测,检出限可达0.18 nmol/L。

3.4 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)法是指将抗体与酶复合物结合,使用显色方式进行检测的方法,广泛应用于疾病诊断、食品安全检测、环境监测等领域。C Y.Zhao等[73]制备了一种用于抗生素检测的超灵敏便携式比色酶联免疫吸附测定传感器,该传感器对氯霉素的检出限达0.005 ng/mL,是传统的纸质ELISA的1/200。

电化学分析法和酶联免疫吸附法凭借快速、简单、对仪器要求低等特点被用于动物源食品中抗生素残留的检测,但二者存在易受干扰、易出现假阳性且准确度较低等问题。

3.5 化学传感法

3.5.1 荧光传感法荧光传感法是利用物质的荧光性质来检测、识别和分析目标物质的方法。而荧光光谱法作为诸多荧光传感法中的一种,是根据物质的荧光波长及强度进行物质的鉴定和检测,具有灵敏度高、选择性强、样品使用量少等特点[74]。在所有抗生素大类中,仅少部分抗生素自身具有荧光特性,故大多数抗生素在采用荧光光谱法检测时都需要依赖荧光探针构建荧光传感体系。常见的荧光探针有碳点(Carbon Quantum Dots, CQDs)、量子点(Quantum Dots,QDs)、多孔金属有机骨架材料(Metal Organic Framework, MOFs)等。其中,CQDs、QDs具有独特的化学性质和优异的光学性能,被广泛用于生物传感器、生物成像等方面。Y.C.Jia等[75]以火龙果皮和1,2-乙二胺为前驱体,采用水热法合成了单一氮掺杂碳点(N-CQDs),并将其作为一种多功能纳米传感器用于3种TCs抗生素的检测。该方法对四环素、土霉素、金霉素的检出限分别为33.8 nmol/L、40.5 nmol/L和41.9 nmol/L,为选择广泛的天然生物质合成CQDs提供了新视角。

此外,一些新型纳米材料已被成功应用于抗生素的检测。例如,X.Y.Yue等[76]采用一步水热法成功合成了发光梭形含Al(Ⅲ)金属有机框架(Al-MOF)纳米片,将其作为荧光探针,通过内滤效应检测牛奶中NFs抗生素。此传感器对呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮的检出限分别为0.53 μmol/L、0.583 μmol/L和0.838 μmol/L,与传统检测方法和其他荧光检测方法相比,该传感器具有快速、灵敏度高、稳定性好、抗干扰性能好等优点。Y.Li等[77]制备了CQDs@HZIF-8配合物,基于F536/F440两种荧光信号的反向变化,构建了用于牛奶中TCs抗生素检测的比例荧光传感器。此方法对四环素、土霉素和多西环素的检出限分别为6.56 nmol/L、29.46 nmol/L和30.58 nmol/L。

3.5.2 比色传感法比色传感法是一类具有样品通量高、检测速度快、灵敏度高、成本低、使用方便等特点的传感技术[78]。该技术的比色信号转导主要有两大类:一类是基于贵金属纳米粒子的聚集,诱导其等离子体吸收光谱发生变化[79]。例如,C.G.Xu等[80]开发了一种以金纳米颗粒(Gold Nanoparticles, AuNPs)作为信号转换元件,采用杂交链反应辅助信号放大的比色法测定卡那霉素的方法。在卡那霉素存在的情况下,适体发夹DNA探针与卡那霉素结合,新暴露的DNA片段引发一连串的杂交链式反应,形成大量的双链DNA(dsDNA);当加入盐时,由于dsDNA与AuNPs之间的排斥作用,AuNPs会形成蓝色聚集体;在最佳条件下,卡那霉素浓度在1～40 μmmol/L范围内,520 nm与630 nm处的吸光度比值下降,检出限为0.68 μmol/L。该方法可选择性地将卡那霉素与其他抗生素区分开来,适用于加标牛奶样品中卡那霉素的检测,回收率较高。另一类是基于各种酶或模拟酶的催化显色反应[79]。例如,P.Lavaee等[81]开发了一种用于检测FQs抗生素的比色测定法,若环丙沙星存在,AuNPs可以发挥其催化活性使溶液颜色从黄色变为无色。该方法对FQs抗生素具有较高的选择性,检出限低至1.2 nmol/L。

综上可知,化学传感法在动物源食品抗生素残留检测中具有色变反应明显、过程简便快速等优势,应用潜力巨大。

4 结语

本文梳理了动物源食品中抗生素的主要类型、残留现状及危害,综述了动物源食品中常见抗生素的残留检测方法,得出:抗生素的主要类型有FQs、BLAs、MA、TCs、NFs、SAs、酰胺醇类和AGs抗生素;抗生素不仅可以预防和治疗家禽疾病,还可用作饲料添加剂促进家禽生长,但过度使用导致的抗生素残留问题屡见不鲜;抗生素残留通过食物链在人体中累积,会导致过敏反应、耐药性等副作用;目前常用的抗生素检测方法有色谱法、光谱法、电化学分析法、酶联免疫吸附法和化学传感法,其中色谱法需要复杂的预处理过程且分析时间较长,难以满足日常生活中对动物源食品抗生素残留的快速即时检测需求;酶联免疫吸附法、电化学分析法等快检方法易受干扰、易出现假阳性且准确度较低。相比而言,化学传感法在抗生素残留检测中具有过程简便快速、色变反应明显等优势,应用潜力巨大。但目前采用化学传感法进行抗生素检测仍存在检测种类少、难以实现多种类型抗生素同时检测等问题。因此,在未来可针对抗生素的结构特性进行深入剖析,开发能与多种及多类型抗生素特征官能团发生特异性作用的传感材料。同时,根据待测抗生素的结构特性对传感材料进行特异性结构优化以增大检测的特异性,为传感法的进一步发展提供新思路和新方法。