GH79家族糖苷水解酶分子进化关系和蛋白结构研究

陈泉冰 曹伟洁 李春，2 吕波

（1.北京理工大学化学与化工学院生物化工研究所医药分子科学与制剂工程工信部重点实验室，北京 102488；2.清华大学化学工程系，北京 100084）

碳水化合物（carbohydrate）是自然界存在最多、具有广谱化学结构和生物功能的有机化合物，是生物体能量储存的重要方式之一，也在维持细胞间通讯、细胞识别和免疫活性的过程中担当重要信息分子的作用。例如糖蛋白和糖脂类碳水化合物为抗体或其他蛋白质提供了附着点，有助于建立细胞间接触促进细胞粘附和信号传递［1-2］。糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH，EC3.2.1），是碳水化合物代谢的关键酶之一，主要参与降解两个或多个碳水化合物，或者碳水化合物与非碳水化合物之间的糖苷键，在动物、植物及微生物的糖和糖缀化合物的水解和合成过程中扮演着不可或缺的角色。蔗糖酶和果聚糖酶等水解酶可水解果聚糖，其产物是原核和真核生物主要的碳能源储备，也是植物信号通路的重要部分，在感应植物营养状况方面起着重要作用。内切菊粉酶也可以用来生产具有多种生理功能的低聚果糖，可以改善胃肠道内部的微生物群落，增加肠道菌群中双歧杆菌等有益菌的数量［3］。甘草酸（GL）是一种重要的五环三萜类化合物，具有抗菌消炎保肝护肝等医用疗效。来源于嗜松篮状菌Li-93（Talaromyces pinophilusLi-93）的β-葡萄糖醛酸苷酶TpGUS79A 可以水解掉甘草酸最外侧的β-葡萄糖醛酸基生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），其具有更高的药效和更高的甜度，可以用作抗炎、保肝护肝类药物的前体和食品添加剂［4-6］。

糖苷水解酶由二糖酶类（蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶等）、葡萄糖苷酶类（纤维素酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等）和其他类型酶（淀粉酶、半乳糖苷酶、透明质酸酶等）组成，根据对寡糖和糖苷底物切割方式的不同分为内切糖苷酶（endoglycosidase）和外切糖苷酶（exoglycosidases）（表1）。其中内切糖苷酶主要作用位点为寡糖及多糖的内部糖苷键，多用于从糖蛋白上切割多糖，例如Endo-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（Endo H；EC3.2.1.96）可裂解直接靠近糖蛋白天冬酰胺残基的两个 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）亚基之间的键。Mitsudome 等［7］从家蚕淋巴中纯化的重组 Endo H 可以将高甘露糖型糖蛋白去糖基化，被认为是糖生物学研究的重要工具。外切糖苷酶主要作用于非还原端的糖苷键，多用于研究游离多糖的特定端基的切割，比如β-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）可在相对温和的条件下水解半乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4 糖苷键，Komba 等［8］使用环状芽孢杆菌来源的 β-半乳糖苷酶开发了一种用于高效制备 N-乙酰乳糖胺的策略，为糖苷酶在糖缀化合物的研究中提供思路。

表1 糖苷水解酶的分类Table 1 Classification of glycoside hydrolases

截至2022年1月，碳水化合物数据库（CAZy）已收录糖苷水解酶111 万个（其中未分类2.7 万个）［9］。根据序列相似性的差异程度，糖苷水解酶被分为173 个糖苷酶家族。GH79 家族作为糖苷酶GH-A 的特殊功能家族，广泛参与了肝素（HP）和硫酸软骨素（CS）等抗凝血药物、抗关节炎药物的生物合成，在肿瘤细胞的侵袭与转移、抗癌药物的开发和自身免疫性糖尿病治疗方面，成为药物研究开发的理想靶标［10］。也在多糖治疗心房纤维颤动或心绞痛的细胞间信号传导等方面受到临床研究的广泛关注［11］。此外，肝素衍生自糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖残基，主要涉及生物合成中的多重和随机酶促修饰的各种取代模式，通过它们在许多生物过程中的结合相互作用来调节许多重要生物蛋白的活性，例如生长因子、细胞因子、病毒蛋白和凝血因子等［12］。目前，GH79 家族在基因克隆、蛋白功能分析上取了一定的进展，但是对于GH79 家族的多样性催化机理仍不清楚，识别底物的结构基础和分子机制尚不清晰。因此，本论文通过对近年来已报道的GH79 家族酶的序列特征、分子结构基础、蛋白结构演变等方面进行阐述，旨在为后续的GH79家族的蛋白质工程和功能催化机制的对应关系奠定基础。

1 GH79 家族的糖苷酶功能的挖掘与分类

目前，国内外学者鉴定与表征了酸杆菌属（Acidobacteria）、拟杆菌属（Bacteroides）和分枝杆菌属（Mycolicibacillus）等细菌来源［13-14］的GH79 家族的糖苷水解酶（图1-A）。在丝状真菌中，已表征的GH79 家族糖苷酶来源主要集中在绿木霉（Trichoderma virens）、黄曲霉（Aspergillus chevalieri）、立枯丝核菌（Zymoseptoria tritici）等霉菌［15］。在高等植物中，主要集中于拟南芥属（Arabidopsis）［16］、玉米（Zea mays）、钝稃野大麦（Hordeum spontaneum）和水稻等禾本科植物。在动物细胞方面，GH79 家族的糖苷酶表征主要集中于小鼠（Mus musculus）［17-18］、人源细胞（Homo sapiens）［19］等模式动物细胞，目前部分已表征的、不同来源、功能多样性的GH79 家族糖苷酶见表2［20］。

表2 GH79 家族不同功能糖苷水解酶Table 2 Different functional glycoside hydrolases of the GH79 family

图1 GH79 家族糖苷水解酶的分布和催化类型分类Fig.1 Distribution and classification of catalytic types of glycoside hydrolases in the family GH79

根据CAZy 数据库的功能蛋白注释，GH79 家族的糖苷酶根据酶所催化的底物类型的不同主要分为以下4 类（图1-B）：（1）EC3.2.1.31，参与β-葡萄糖醛酸苷类的多糖水解，与GH2 家族的葡萄糖醛酸苷酶功能相似，主要水解O-糖苷键或S-糖苷键，释放出对应的苷元，广泛的存在于高等植物、丝状真菌、细菌和酵母菌中［29，33-34］。（2）EC3.2.1.36，参与透明质酸葡萄糖苷的水解，主要水解葡萄糖醛酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,3 糖苷键，广泛存在于细菌、水蛭和哺乳动物中。（3）EC3.2.1.166，参与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中硫酸乙酰肝素链的β-1,4 糖苷键的内水解。主要作用在植物多糖、哺乳动物细胞的多糖水解和细胞信号传导过程，乙酰肝素酶底物谱较广，硫酸乙酰肝素（HS）是一种糖胺聚糖，是细胞外基质（ECM）的关键成分［35-36］。硫酸乙酰肝素（HS）的分解在乙酰肝素酶（HPSE）作用下进行，HPSE 的过表达导致细胞外HS 的分解和储存的生长因子的释放，因此与癌症的转移密切相关。（4）EC3.2.1.167，参与黄芩苷类化合物的水解［28］。β-葡萄糖醛酸酶已被证明可以从阿拉伯半乳聚糖蛋白中释放葡萄糖醛酸（GlcUA）和4-O-甲基-GlcA［15，37］，来源于黄芩的β-葡萄糖醛酸苷酶可以水解黄酮的7-O-β-葡萄糖醛酸苷，并且参与H2O2的代谢，因此在过氧化物酶反应过程中大量的 H2O2被有效解毒［28］。

从催化底物的键选择性区分，GH79 家族的β-葡萄糖醛酸苷酶、透明质酸糖苷酶、黄芩苷β-葡萄糖醛酸苷酶仅能水解β-糖苷键，起外切糖基的作用，而乙酰肝素酶仅能水解α-糖苷键，起内切糖基的作用，对细胞内的长链糖类物质起分解作用［27］。从共进化的角度分析，肠道微生物菌群也参与了宿主的代谢调节和免疫防御，如链球菌属［38-40］、葡萄球菌属［41-42］、棒状杆菌属［43-44］、产碱菌属［45］等菌属中存在的β-葡萄糖醛酸苷酶类、多糖类的糖苷水解酶参与碳水化合物和能量代谢，从而有助于抵御致病细菌的入侵。此外，弧菌与鱿鱼依赖与上皮黏液的共生关系［46］，玉米（Zea mays）和玉米瘤黑粉病菌（Sporisorium reilianum）、大麦和网斑病菌（Pyrenophora teres）之间寄生和拮抗作用［47-48］，显示了GH79 家族糖苷酶也可能参与了物种间共生体或水平基因的迁移。

2 GH79 家族糖苷酶的分子进化关系分析

长期以来人们已经注意到催化机制和分子机制对于绝大多数糖苷酶家族以及催化口袋的几何形状都是保守的，通过对同一家族的糖苷水解酶进行分子进化分析和结构功能预测，揭示蛋白质之间的共进化关系，深入研究其序列和催化作用机理之间的对应关系，从而拓展其应用范围。为了进一步揭示GH79 家族不同水解功能的糖苷酶的亲缘关系，选择了来源于动物、植物、真菌、细菌以及同一来源不同反应类型的55 种不同的糖苷酶序列进行分子进化树分析。通过Clustalx 对GH79 家族已经表征的酶的氨基酸序列进行比对，然后利用Mega 进行分子进化树的构建和亲缘关系分析［49-50］，结果如图2所示。目前，GH79 家族糖苷水解酶的研究主要集中于EC3.2.1.166 反应类型的肝素酶一支，主要行使硫酸肝素蛋白聚糖中硫酸肝素链（1 →4）-β-D-糖苷键的内切水解功能。例如，Vinader 等［51］研究发现来源于GH79 家族的乙酰肝素酶通过催化硫酸乙酰肝素的葡萄糖醛酸（GlcUA）和葡萄糖胺（GlcNAc）之间的（1,4）糖苷键，生成GlcUA-GlcNAc 的最小二糖单元。目前GH79 家族EC3.2.1.36 反应类型的糖苷酶仅有江南大学的康振教授团队表征并报道的水蛭透明质酸酶LHyal 一种，可特异性水解透明质酸中的GlcNAc-GlcUA-GlcNAc的β-1,3 糖苷键，生成GlcNAc-GlcUA 的二糖单元［27］。其余GH79 家族的糖苷水解酶同源关系较近且集中于EC3.2.1.31 水解类型的β-葡萄糖醛酸苷酶，进化显示其序列相似度较高，水解方式也大体相同。

图2 GH79 家族不同功能糖苷水解酶进化树Fig.2 Phylogenetic tree of glycoside hydrolases with differ-ent functions in the GH79 family

此外，来源于黄芩的黄芩苷β-葡萄糖醛酸酶（EC3.2.1.167）与其他β-葡萄糖醛酸苷酶的水解模式略有差别，能够催化黄芩苷水解生成对应的黄芩素和β-葡萄糖醛酸，但不能使用甘草甜素、石膏素-3-O-D-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-7-O-D-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-D-葡萄糖苷作为底物。李春课题组筛选到一株丝状真菌-嗜松篮状菌，产生β-葡萄糖醛酸苷酶（TpGUS79A）属GH79 家族，主要功能是可以特异性水解β-1,3 糖苷键将甘草酸转化成单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），而不会进一步水解GAMG 生成甘草次酸（GA），分子进化树显示该酶在GH79 家族糖苷酶水解分类中处于单独的一个分支，与GH79 家族的鼠李糖基-β-D-葡萄糖醛酸酶（FoBGlcA）、乙酰肝素酶同源性不足30%，推测该家族除了存在糖基识别特异性之外，对苷元的识别也存在一定的特异性。此外，进化树显示其中还有很多未被命名的蛋白，这些未命名的蛋白与其他的酶的序列相似性均不高，都在40%以下甚至更低，因此通过序列之间进化关系及亲缘远近推测其催化功能仍然存在一定的盲点。如何通过酶进行序列和结构比对，从而建立GH79 家族功能性的结构特征和氨基酸残基的识别规律具有重要的理论研究意义［29］。

从GH79 家族不同功能的糖苷水解酶进化树可以发现，该家族不同功能的糖苷水解酶在进化关系上并不具有较强的亲缘关系，主要原因是该家族同一功能的糖苷酶来源较为固定且单一，比如乙酰肝素酶均来源于哺乳动物，同时发现在整个GH79 家族中具有EC3.2.1.167 水解功能的黄芩β-葡萄糖醛酸苷酶（sGUS）和具有EC3.2.1.36 水解功能的透明质酸酶目前均只有一种，因此难以仅从进化关系上推测GH79 家族未知糖苷酶的功能，基因序列同源性低，这可能也是GH79 家族糖苷水解酶催化机制解析进展缓慢的主要原因之一。

3 GH79 家族的催化机制的表征

目前，糖苷水解酶的催化机制主要有两种，一种是保留型反应，一种是反转型反应，其主要区别在于水解过程中异头碳构象是否变化（图3）。保留型反应不会造成异头碳构象的变化，而反转型反应会导致异头碳构象有α 和β 之间的转化［52-54］，反转型糖苷水解酶的两个催化残基之间的距离为7-10 Å，保留糖苷水解酶的距离为5-6 Å［55］。基于氨基酸的序列相似性，GH1、GH2、GH3 和GH79 家族糖苷水解酶催化机制比较类似［52-54］，比如β-葡萄糖醛酸苷酶在催化糖苷键的断裂时，谷氨酸/天冬氨酸等关键残基参与广义的酸（碱）催化反应完成，其中一个残基是质子供体，另一个是亲核基团/碱性基团。对GH79 家族已经表征的酶的序列以及已成功鉴定活性中心的TpGUS79A 进行氨基酸的序列比对，序列之间的相似性（similarity）只有30%-48%左右，但均具有GNE 和ETNS 等高度保守的特征功能结构域（图4），GNE 区域中的谷氨酸残基为质子供体，而ETNS 区域的谷氨酸残基为亲核基团/碱性基团。Michikawa 等［13］解析的首个GH79 家族β-葡萄糖醛酸苷酶（AcGlcA79A）结构显示，催化残基为Glu173 和Glu287，分别起酸/碱和亲核试剂的作用，且催化位点Glu173 和Glu287 之间的距离为5.25 Å，符合保留型的催化机理。

图3 糖苷水解酶的催化机制Fig.3 Catalytic mechanism of glycoside hydrolase

图4 GH79 家族已鉴定活性中心糖苷水解酶的氨基酸序列比对Fig.4 Amino acid sequence alignment of the identified active center glycoside hydrolases of the GH79 family

目前GH79 家族中乙酰肝素酶及大多数动物来源的水解酶多采用内切机制，如Wu 等［56］表征的GH79 家族的人源乙酰肝素酶（HPSE），其催化机制被鉴定为糖苷保留型催化机制，其催化位点分别为Glu343 和 Glu225 残基，分别在催化过程中行使亲核试剂和酸/碱的功能。江南大学康振课题组报道了GH79 家族的水蛭来源的透明质酸酶（LHyal）的晶体结构，其功能是水解透明质酸的β-1,3 糖苷键，催化位点分别为位于中央β 折叠上的C 末端的谷氨酸残基Glu176 和Glu290［27］。与内切机制不同的是，来源于真菌、细菌等GH79 家族的糖苷水解酶采用外切水解机制，例如来源于荚膜酸杆菌的β-D-葡萄糖醛酸苷酶AcGlcA79A［13］和来源于尖孢镰刀菌的4-O-α-L-鼠李糖基-β-D-葡萄糖醛酸苷酶（FoBGlcA）［21］均具有外切β-葡萄糖醛酸的能力。Kondo 报道的来自尖孢镰刀菌的4-O-α-L-鼠李糖基-β-D-葡萄糖醛酸苷酶FoBGlcA 可以水解阿拉伯树胶生成L-鼠李糖和D-葡萄糖醛酸，序列比对表明 FoBGlcA 与已经报道的AcGlcA79A 的序列同源性较低（19%），与GH79 家族其他17 种β-葡萄糖醛酸苷酶相似度仅为4%-20%。序列比对和突变验证结果显示，Glu164 和Glu284 分别为FoBGlcA 的催化酸/碱残基和亲核试剂残基。总体来说，GH79家族催化特征氨基酸存在高度保守，与 GH-A 家族其他成员水解酶催化特征一致，但仅通过序列相似度推断GH79 家族是否内切或外切的水解模式目前仍然存在一定的难度。

4 GH79 家族的蛋白结构解析

迄今为止，GH79 家族三级结构解析及结构功能分析进展缓慢。已经成功解析的GH79 家族酶的三维结构仅有5 种。2012年Michikawa 等［13］首次表征了GH79 家族荚膜酸杆菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶AcGlcA79A，其具有β-葡萄糖醛酸的活性，催化效率Km和kcat分别为（0.015±0.001）mmol/L 和（34±1）/s，最适催化温度和pH 分别为50℃和pH 3.0。通过硒代蛋氨酸结晶衍射方法，获得了其蛋白结构（PDB ID：3VNY）及其与葡萄糖醛酸（GlcUA）、葡萄糖醛酸-（1-4）-葡萄糖底物分子的复合物晶体结构（PDB ID：3VNZ & 3VO0），分辨率分别为1.50 Å、1.80 Å 和1.90 Å。晶体结构显示，AcGlcA79A 为单亚基酶，由一条包含488 个氨基酸的多肽链和附加的C 末端残基（476-KLAAALEHHHHHH-488）组成，分子量为52 kD，具有典型的（β/α）8形成的TIM桶状结构域和8 个β 折叠形成的三明治结构域（图5）。其中（β/α）8的TIM 桶状结构域与GH2 家族其他典型的β-葡萄糖醛酸苷酶的催化结构几何偏差为2.6 Å，具有典型的β-葡萄糖醛酸苷酶的水解能力，其中分别行使催化酸碱和亲核攻击作用的Glu173 和Glu287 位于TIM 桶状结构域的β4 和β7 折叠上。

2015年格里菲斯大学的Bohlmann 等［14］解析了来源于类鼻疽伯克氏菌乙酰肝素酶（BpHep）的X射线晶体结构（PDB ID：5BWI），分辨率为1.60 Å。这是 GH79 家族报道的首个具有内切水解作用的β-葡萄糖醛酸苷酶的晶体结构。与AcGlcA79A 不同的是，BpHep 为异源二聚体，每个单体分别包含一个（β/α）8的TIM 桶状的催化域和β 三明治结构域（图5）。在BpHep 的催化结构域中，催化残基Glu144和Glu255 分别行使酸碱质子供体和亲核试剂的功能。和人源乙酰肝素酶hHep 结构不同的是，BpHep结构中的loop 环区Gly66-Thr89 对应于hHep 无活性的接头结构域（Ser110-Gln157），该loop 可能阻断了乙酰肝素酶与底物硫酸乙酰肝素（HS）结合位点，在催化过程中必须移除此linker 区域才能使其与底物硫酸乙酰肝素HS 正确的结合，该loop 环区在 AcGlcA79A 的结构中也有类似的存在［56］。该loop结构上的差异可能为GH79 家族糖苷酶底物的特异性识别提供了新的思路。

图5 GH79 家族已解析结构的蛋白结构示意图Fig.5 Schematic representation of the resolved protein structures of the GH79 family

2015年约克大学的Davies 团队成功解析GH79家族人源的乙酰肝素酶（HPSE）（PDB ID：5E9C）的晶体结构，分辨率为1.73 Å。其结构是由两个不对称的单个异二聚体构成的异源二聚体，大亚基50 kD，小亚基只有8 kD（图5）［56］。与前面GH79 家族解析的结构一样由（β/α）8的TIM 桶状结构域和β 三明治结构域组成。值得注意的是HPSE 包含6 个N-糖基化位点，均位于50 kD 亚基上。糖链存在对蛋白结构的X 射线衍射具有不利影响，作者利用糖苷内切酶H（Endo H）切除了其糖链成功获得了HPSE 的规则晶体结构。在含有糖链修饰的GH79家族的糖苷酶表征方面，Kondo 等［21］利用Endo H糖苷酶处理，通过蒸汽扩散法优化晶体结构，解析出了GH79 家族首个来源于尖孢镰刀菌的β-葡萄糖醛酸苷酶FobglcA（PDB ID：7DFQ）及其与底物4-O-α-L-鼠李糖基-β-D-葡糖醛酸结合的复合物晶体结构（PDB ID：7DFS），分辨率分别为1.51 Å 和1.49 Å。该酶含有3 个糖基化位点，分子量在50 kD左右，为一个单体酶（图5），该研究进一步丰富了GH79 家族糖基化的β-葡萄糖醛酸苷酶的结构数据库。此外，2021年江南大学康振教授课题组也成功解析该家族水蛭来源的透明质酸酶（LHyal）的蛋白结构（PDB ID：7EYO），分辨率为1.9 Å（图5），该酶在氨基酸序列的184 和249 位的存在着两个N-糖基化。LHyal 具有由（β/α）8的TIM 桶状结构域和β 三明治结构域组成的GH79 家族的典型结构特征，与GH79 家族其他已解析结构的糖苷酶具有很高的结构相似度。例如与已解析的BpHep 催化结构几何偏差为1.28 Å，催化残基Glu176 和Glu290 分别行使酸碱质子供体和亲核试剂的功能［27］。尽管LHyal 与其他已报道的GH79 的蛋白相似度很高，但LHyal 的结合口袋的裂缝一侧具有一个较长的loop环（D72-Q104），称为可变的“外口袋”环。与该家族已经解析结构的其他四种酶相比，“外口袋”环的结构可能影响糖苷水解酶切割底物的作用模式，AcGlcA79A 和FoBGlcA 是外切水解酶，其“外口袋”环N88-R113 和D71-S90 相对较短，形成了额外的翻转只能容纳小分子底物的进入，而 HPSE 的“外口袋”环D105-N162 通过蛋白水解切除6 kD 接头肽暴露了结合缝隙，从而具有内切的水解机制（图6）［27］。该研究为进一步理解GH79 家族的底物的识别机制以及为蛋白的分子进化的关系提供了新的思路。

图6 GH79 家族蛋白结构已知的具有不同作用模式的“exo-pocket”loop 比较Fig.6 Comparison of “exo-pocket” loops with different modes of action for known structures of GH79 family proteins

5 结论与展望

目前，许多研究者通过序列比对、分子进化分析和结构解析等策略成功的鉴定了五种的GH79 家族的酶，但由于GH79 家族的序列多样性丰富，整体的表征的序列样本数仍不够，导致GH79 家族的多样性识别底物的结构基础和分子机制尚不清晰。如何通过GH79 家族成员的共同序列特征和结构功能特征进行高效的挖掘表征也是亟待解决的问题。例如在序列方面，开发多数据驱动的组学分析技术，加快基于序列特征的定量化、高通量的挖掘与表征策略，建立样本-数据-特征的信息流指导的挖掘平台。在蛋白方面，运用Rosetta 或AlphaFold 等蛋白预测模型，建立多元的催化与结构的对应模型，通过结构特征与功能之间的关联性，实现未知蛋白的功能解析与表征。随着机器学习、组学驱动等技术的进一步发展，均为GH79 家族β-葡萄糖醛酸酶的系统进化、功能研究提供了新的理论指导和坚实基础，也为我们了解GUS 酶的蛋白结构和功能的对应关系提供了新的思路和研究方向。