解磷菌PSB-R全基因组测序鉴定及其解磷特性分析

王帅 吕鸿睿 张昊 吴占文 肖翠红 孙冬梅，2

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 黑龙江省寒区环境微生物与农业废弃物资源化利用重点实验室，大庆 163319；2.农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室，大庆163319）

磷是植物生长不可或缺的第二大量元素，在植物的生长代谢过程中发挥着重要作用。缺磷将影响农作物氮的有效积累并导致光合作用效率降低，降低作物的产量与质量［1］。一方面，磷在环境中广泛存在，我国耕地土壤中磷素含量丰富，但其中95%的磷元素是以矿物态存在，植物能够直接吸收的可利用态略低［2］；另一方面，磷在环境中释放后，往往很难回收，因此目前面临“磷枯竭”问题。此外，过多的磷释放反而又导致了环境磷对水体的污染，如富营养化问题［3］。因此，提高土壤磷利用的研究仍有重要意义。现有研究表明，向土壤中施加解磷微生物能够有效改善土壤理化状况，提高作物的产量［4-5］。现有研究显示，已分离到的解磷细菌主要集中在厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的17 个属中［6-7］，如芽孢杆菌属（Bacillus）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、链霉菌属（Streptomyces）；解磷真菌［8］主要是曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和菌根菌（Arbuscularmy）。

目前解磷菌的研究应用仍存在问题有待解决。首先，部分解磷菌稳定性不佳，存在多次传代后解磷能力退化的现象［1,9］；其次，解磷菌的解磷机制尚未完全探明，同一解磷菌在不同环境下发挥解磷作用的机制并不相同［1,7,9-10］。作为分子机制研究的基础，目前已解析的解磷菌基因组信息较少，仍需要研究者们不断补充新的基因组信息作为解磷机制研究的数据基础。为了克服上述瓶颈，近些年来学者们不断尝试从各种环境中分离出新的解磷菌株［11-14］，并对能力较强的解磷菌进行全基因组测序［15］，尝试解析解磷菌发挥作用的分子机制。

本研究分离得到一株对多种难溶性磷酸盐均具有解磷能力的解磷菌株PSB-R，通过响应面优化培养条件探究了其最大的解磷能力；在多次传代培养后解磷能力能够稳定保持在较高水平，具备应用于农业生产的潜力，为适用于东北地区的微生物菌肥开发和研制提供新的菌种资源。另外本研究还利用二代测序平台Illumina NovaSeq PE150 进行了全基因组测序并分析预测了PSB-R 包含的与解磷能力和植物促生相关基因，为进一步从分子角度研究PSB-R解磷机制提供了基因组数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料

无机磷培养基（g/L）：葡萄糖10.0，硫酸铵0.5，氯化钠0.3，氯化钾0.3，硫酸镁0.3，硫酸亚铁0.03，硫酸锰0.03，磷酸三钙10.0，pH 自然。固体培养基按比例添加1.3%琼脂粉。

NA 培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，牛肉粉 3.0，氯化钠 5.0，pH 自然。固体培养基按比例添加1.3%琼脂粉。

细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PSB-R 的鉴定 将PSB-R 分别接种在无机磷固体培养基与营养琼脂表面，观察菌落形态特征；取一环细菌进行简单染色，观察菌体形态；使用通用引物27F 和1492R 扩增16S rRNA 基因序列，序列上传至国家微生物科学数据中心登录号为NMDCN0000R23。将PSB-R 的16S rRNA 基因序列上传至EzbioCloud 数据库进行比对，根据比对结果构建系统发育进化树。结合16S rDNA 分类结果设计生理生化试验。最后使用MiGA 对基因组测序数据进行ANI 分析，确定PSB-R 分类地位。

1.2.2 全基因组测序数据处理和分析 使用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取PSB-R 基因组DNA，测定浓度及质量符合测序要求后进行DNA 文库构建并测序，测序平台为Illumina PE150。测序得到的原始数据过滤掉质量值较低信息后使用SOAPde novo（version 2.04）进行组装，并对基因组碱基数量、（G+C）%、scaffold 数量等数据进行统计分析。组装好的基因组信息上传至国家基因组数据中心［16］。使用GeneMarkS（Version 4.17）软件对PSB-R 基因组进行编码基因预测；采用KEGG 数据库对PSB-R 基因组信息进行功能注释。采用antiSMASH 程序对PSB-R 进行次级代谢产物预测。根据KEGG 数据库结果，结合前人研究结果对基因组中植物促生相关基因进行筛选。

1.2.3 培养基中可溶磷含量及铁离子含量测定方法 培养基中可溶性磷含量的测定方法和相关试剂配置方法参考NY/T 2421-2013 植株全磷含量测定钼锑抗比色法［17］进行。具体方法为：取离心后的培养基1 mL 加入已装有15 mL 蒸馏水的容量瓶（25 mL）中，加入100 μL 二硝基酚指示剂，滴加适量浓度为0.05 mol/L 的稀硫酸溶液，使容量瓶中溶液颜色变为淡黄色，再向容量瓶中加入2.5 mL 钼锑抗显色液并用蒸馏水定容至刻线，颠倒混匀后置于25℃温箱静置30 min，测定反应液在波长700 nm 处的吸光度。

培养基中铁离子含量的测定方法和相关试剂配置方法参考GBT2441.4-2010 尿素的测定方法 第4部分铁含量的测定邻菲啰啉法［18］进行。

1.2.4 PSB-R 最大解磷能力检测 分别将无机磷培养基中碳源替换为果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉；氮源替换为硝酸钠、硝酸钾、尿素、氯化铵。摇床参数设置为28℃，140 r/min 培养2 d 检测培养基中可溶磷含量。以单因素试验为基础，通过Design-Expert 13 软件以Box-Benhnken 法设计响应面试验。以培养基中磷含量为响应值，考察碳源浓度（A）、氮源浓度（B）、pH 值（C）不同数值组合对响应值的影响。根据响应面拟合方程推测PSB-R 最大解磷能力并验证。

1.2.5 PSB-R 溶磷能力稳定性分析 将分离菌株以1%接种量接种至无机磷培养基中，连续传代10 次，检测培养基上清可溶性磷含量及pH 值变化情况。

1.2.6 PSB-R 对其他难溶性磷酸盐的溶解能力 将

1.2.4 中优化后的无机磷培养基中的磷酸三钙替换成过磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、羟基磷灰石和氟磷灰石。每2 d 检测培养基中的可溶性磷含量，使用Excel 对数据进行分析并绘制折线图。

2 结果

2.1 PSB-R鉴定结果

PSB-R 在营养琼脂生长的菌落形态为圆形，表面光滑，能产生红色素；在无机磷固体培养基表面生长时不能产生红色素，菌落表面粗糙，周围有透明圈。使用结晶紫对PSB-R 进行简单染色，镜检显示菌体呈蓝紫色，短杆状，大小约为0.5 μm×1.0 μm。16S rRNA 基因序列上传至EZbiocloud 数据库进行比对，结合MEGA7.0 软件以Neighbor-joining 方法构建基于16S rRNA 基因序列的系统发育树。结果显示PSB-R 与Serratia marcescensATCC 13880 和S.nematodiphilaDSM 21420 相似性均达到99%；平均核苷酸一致性（ANI）分析结果显示，PSB-R 与S.marcescensGCA 004684145T 和S.marcescensATCC 13880 的ANI 数值最为接近，分别为98.88% 和98.53%。根据《伯杰氏手册》设计生理生化试验，结果显示PSB-R 能够利用多种碳源产酸，能够在低温和高盐环境下生长。综合上述实验分析结果，鉴定PSB-R 为粘质沙雷氏菌，实验结果见图1。

图1 PSB-R 鉴定结果Fig.1 Identification results of PSB-R

2.2 PSB-R基因组组装结果

将测序得到的原始数据去除质量较低的 reads，过滤得到的有效数据（Clean Data）。Clean Data 的碱基含量和质量分布见图2。使用GeneMarkS 对基因组序列进行基因预测，基因组组装信息与基因预测结果见表1。将PSB-R 基因组数据上传至国家基因组数据中心，登录号为GWHBGBR00000000。

表1 基因组装配统计Table 1 Assembly statistics of genomes

图2 碱基含量与质量分布图Fig.2 Base content and mass distribution map

2.3 PSB-R基因组注释结果

使用KEGG 数据库对PSB-R 基因组进行注释分析，结果显示共有4 603 条基因被注释，共包含226条代谢通路。其中代谢途径（metabolic pathway）注释到基因数量最多，共有733 条基因归属其中；注释基因数量占比第二的通路途径为次级代谢产物合成（biosynthesis of secondary metabolites），共注释到316 条基因。KEGG 基因组注释结果表明，PSB-R 具有复杂的代谢途径，并拥有多种次级代谢产物合成能力。为进一步预测PSB-R 的次级代谢产物生产能力，运用antiSMASH 程序进一步预测PSB-R 次级代谢产物生产情况，结果显示PSB-R 具有4 种次级代谢基因簇，分别为NRPS、NRPS-like、硫肽类抗生素和β-内脂。其中NRPS 最多，共注释到4 条基因簇包含158 条基因。

基于KEGG 数据库注释获得数据及通路图，分析PSB-R 基因组中解磷基因的组成情况。基因的预测结果见表2。PSB-R 具有完整的吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）合成簇，同时具有的PQQ 依赖型葡萄糖脱氢酶基因（gcd）。除了葡萄糖脱氢酶外，PSB-R 还具有无机焦磷酸酶（ppx、ppa）、碱性磷酸酶（phoA）及有机磷水解酶（phnX）等磷酸盐化合物降解酶的编码基因。此外KEGG分析结果显示，PSB-R 具有铁载体合成的完整通路，能够合成并分泌铁载体。另外，KEGG 注释显示PSB-R 含有合成吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）所必需的ipdC 基因、几丁质酶编码基因chi。

表2 促生基因预测情况Table 2 Prediction of growth-promoting genes

2.4 PSB-R最大溶磷能力检测

对培养基碳源、氮源及pH 值进行单因素优化实验。图3-A，B 显示以果糖作为培养基的碳源时PSB-R 解磷能力最强。在果糖浓度较低范围内（1%-4%）解磷能力随果糖浓度提高不断增强且差异显著；当果糖浓度达到较高水平（4%-10%）时，随着果糖浓度的提高，培养基中可溶磷含量趋于稳定。图3-C，D 为氮源优化结果。可以看出培养基中氮源为铵态氮时PSB-R 的解磷能力较强，为硝态氮时解磷能力较弱，而在以尿素作为氮源时可溶磷含量为0。为获得相对最佳的氮源浓度，将培养基中硫酸铵浓度替换为不同浓度。从图3-D 可看出，硫酸铵浓度在6%-8%时培养基中可溶磷含量处于较高水平，当硫酸铵浓度提高到10%，可溶磷含量显著下降。调节培养基初始pH 值分别为4、5、6、7、8、9、10，培养2 d 测定可溶性磷含量（图3-E）。结果显示，可溶性磷含量在pH 5-10 的范围内与培养基初始pH 呈现反比。当培养基pH 值由5 下降到4 时，可溶性磷含量降低且差异显著（P< 0.05）。

图3 单因素试验优化结果Fig.3 Optimized results by single factor test

在单因素试验基础上，以果糖浓度、硫酸铵浓度和初始pH 值作为试验因素，利用Design-Expert 13 软件设计了34 组3 因素Box-Behnken 响应面试验。对实验结果进行方差分析，由F值大小可判断出3 个因素对可溶磷含量影响的高低，从大到小依次为A（果糖浓度）>B（硫酸铵浓度）>C（pH 值）。模型P<0.000 1 表示显著，失拟项F值为0.47，P值为0.500 5，表明不显著。以上说明该模型拟合精度较好可进行后续优化实验。证明多项式中各因素对响应值的影响P<0.05，表明各因素对响应值结果影响显著。交互项AB，AC，BC 的P<0.05，说明实验各因素间均具有相互作用且对可溶性磷含量影响显著。图4显示的是因素A（果糖浓度）与因素B（硫酸铵浓度）对可溶性磷含量的交互作用。相对于因素AC 与因素BC，因素AB 的曲面更陡，等高线更加密集，说明因素A 与因素B 的交互作用对结果的影响最大。

图4 可溶性磷含量的响应面模型Fig.4 Response surface model of soluble phosphorus concentration

软件分析显示最优结果的培养条件为：A=4.847 04%，B=7.304 73%，C=4.745 59，即果糖浓度4.847 04%、硫酸铵浓度为7.304 73%、pH 值为4.745 59。在该培养条件下，响应面模型预测可溶性磷含量为805.199 mg/L。

按照果糖浓度4.85%、硫酸铵浓度为7.31%、pH 值为4.75 配置培养基，测定结果显示可溶性磷含量为807.976 mg/L，相对理论值的相对误差为0.345%。

2.5 PSB-R溶磷能力稳定性检测

将PSB-R 连续传代培养10 次，测定培养基中可溶性磷含量与pH 值变化情况。从图5可看出，PSB-R 的解磷能力较为稳定，除第一代溶磷量为466.227 mg/L 外，后续培养基中可溶性磷含量均稳定在600 mg/L 左右，培养基pH 值均可稳定在4 左右。实验结果证明，PSB-R 的解磷能力稳定性较好，未出现随着传代次数增加而解磷能力大幅降低的现象。

图5 解磷能力遗传稳定性分析Fig.5 Genetic stability analysis of phosphorus solubilizing ability

2.6 PSB-R对其他难溶性磷酸盐的溶解能力

将无机磷培养基中的磷酸三钙替换为其他种类难溶性磷酸盐。每隔2 d 对可溶性磷含量进行测定，结果如图6。可以看出PSB-R 对过磷酸钙的溶解能力明显优于其他4 种难溶性磷酸盐。此外，以过磷酸钙和羟基磷灰石作为难溶性磷酸盐的培养基中可溶性磷含量的变化呈现相似的趋势，即可溶性磷含量在上升至一定浓度后开始下降，一段时间后再次提升；磷酸铁组在第一次测定时可溶性磷含量最高，之后逐渐降低；以氟磷灰石作为难溶性磷酸盐的培养基中可溶性磷酸盐浓度随时间逐渐上升的趋势；以磷酸铝作为培养基磷源的实验组数据显示，PSB-R对磷酸铝溶解能力较差。

图6 PSB-R 对其他难溶性磷酸盐的溶解能力Fig.6 Solubility of PSB-R to other insoluble phosphates

为了确定磷酸铁组中解磷能力的下降是否与培养基中铁离子含量增高抑制细胞活性相关，测定了培养基中铁离子含量的变化情况，结果如图7所示。实验结果显示，培养第5-7 天时，铁离子浓度维持在30 mg/L 左右，铁离子含量与可溶性磷含量的变化呈现负相关，证明铁离子浓度是影响PSB-R 解磷能力的重要影响因素。

图7 培养基中铁离子含量变化情况Fig.7 Change of ferric ion content in culture medium

3 讨论

据国家统计局统计［19］，2020年我国人口总数已达到14.43 亿人，为确保充足的粮食供应，在过去的几十年里，人们通过大量施加化肥的方法提高农作物产量。大量施加化肥虽然能提高农作物产量，但过量施用会导致土壤盐碱化等多种环境问题发生并最终导致作物产量降低。施用生物肥料来替代部分化肥能够在确保产量的同时减少化肥对环境的破坏。由此看来，开发高效的生物肥料对我国农业发展至关重要。国内现有报道的解磷菌多分离自较温暖地区的农田、湖泊沉积物等地［20-21］，这些地区分离出的解磷菌不适应寒冷地区的低温环境，施用时不能充分发挥解磷能力。因此，筛选出适合当地生境的低温、高效的解磷菌制成生物肥料是提高黑龙江地区生物肥料应用效果的根本方法。此外，由于解磷菌多具有吸附重金属离子，调节土壤pH 值等作用，所以施加解磷菌的生物肥料对改善黑土土壤性状，提高黑土土壤肥力具有重要作用。目前国内关于低温解磷菌的报道仍较少。朱德旋等［22］从佳木斯地区的寒地土壤分离出一株伯克霍尔德菌B51-7，可溶性磷含量最高为832.74 mg/L，同时能够抑制多种植物病原菌的生长；赵伟进等［23］从西藏地区的主粮作物青稞根际分离出多株能显著促进青稞种子萌发和根部发育的低温解磷菌，为西藏地区青稞微生物菌肥的研制提供了功能菌等。

本研究针对前期通过平板筛选等方法获得一株具有较大溶磷圈的解磷菌PSB-R，通过16S RNA 基因序列构建系统发育进化树结合基因组ANI 分析与生理生化试验结果，最终鉴定PSB-R 为粘质沙雷氏菌。沙雷氏菌是广泛存在于土壤，水体等环境中的一类革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，周生鞭毛具有运动能力，多数菌种能产生红色的灵杆菌素，在多个领域具有广泛应用［24-26］。现有解磷菌研究多集中于解磷能力检测与代谢物检测，从基因组水平针对解磷菌分子调控机制的研究仍较少。本研究采用二代测序技术对PSB-R 进行基因组测序，为解磷分子调控机制的研究提供基因组数据作为研究基础。除了解磷相关基因，本研究还分析预测了与解磷、铁载体、IAA 产生、拮抗病原真菌等相关基因的组成情况，为探究PSB-R 其他植物促生功能提供思路参考。

为了挖掘PSB-R 作为解磷菌的应用潜力，首先设计了响应面试验以期获取PSB-R 对磷酸三钙的最大溶解能力，试验结果表明PSB-R 发挥解磷作用的前提是培养基的氮源必须为铵态氮，这一结论与王俊娟［10］、乔志伟等［27］的研究结果一致。乔志伟等［27］对分离出的拉恩氏菌（Rahnellasp.）在不同氮源条件下培养产生的代谢物进行了检测，发现解磷菌利用铵态氮与硝态氮产生的有机酸种类不同，并推测是造成同一解磷菌在不同氮源培养条件下解磷能力差异明显的原因。王俊娟等［10］同样认为解磷菌在不同氮源条件下产酸种类不同外，还认为解磷菌同化NH+4时释放的H+是促进难溶性磷酸盐溶解的一种途径。

其次通过多次传代试验验证了该菌株的解磷能力稳定情况，从培养基中可溶磷含量与pH 值两个水平证实PSB-R 的解磷能力能稳定存在10 代，未出现前人文献描述的解磷能力衰退或丢失等现象。最后将磷酸三钙替换为其他种类难溶性磷酸盐，探究了PSB-R 对其他种类难溶性磷酸盐的溶解情况。研究结果显示PSB-R 对磷酸三钙、羟基磷灰石和氟磷灰石等均具有明显的溶解能力；对于与金属离子结合的磷酸盐，培养结果显示以磷酸铁作为磷源的实验组第一次测定时可溶磷含量高于其他种类磷源，且随培养时间延长逐渐降低。推测这一现象可能是由于培养初期PSB-R 利用磷酸铁作为磷源，培养基中铁离子水平高于其他组，生长速度快，溶解磷酸铁能力较高。而随着磷酸铁溶解量的增高，培养基中铁离子含量超过菌体生长要求范围，造成菌体生长迟缓或休眠，代谢减弱，从而导致可溶磷含量不断降低。为了证实这一猜想，对以磷酸铁作为磷源的培养基中铁离子浓度进行了连续测定，实验结果显示铁离子浓度与可溶磷含量的变化呈现负相关，由此认为铁离子浓度的增高是抑制PSB-R 解磷能力的原因。

4 结论

本研究鉴定解磷菌PSB-R 为粘质沙雷氏菌。PSB-R 包含葡萄糖酸产生、磷酸盐降解酶等解磷基因和铁载体及几丁质酶等植物促生相关基因；培养条件优化试验确定PSB-R 的最大解磷能力为807.976 mg/L。连续培养10 代，PSB-R 发酵液的pH 稳定在4 左右，同时可溶磷含量能够稳定维持在600 mg/L。PSB-R 对磷酸三钙、羟基磷灰石、氟磷灰石及磷酸铁均具有溶解能力，但铁离子浓度大于30 mg/L 时解磷能力受到抑制。