急性胰腺炎患者血清miR-181a-5p表达及与Th17/Treg免疫平衡的关系

张 瑜， 辛前有， 冯亚飞， 郭 伟

(1.山西省长治市北大医疗潞安医院普通外科， 山西 长治 046200 2.长治医学院附属和济医院胃肠外科， 山西 长治 046011)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常见的消化系统急症，其病情进展迅速，极易引发全身炎症反应综合征，导致多器官功能障碍或衰竭，致残致死率高[1]。近年来随着人口老龄化进展和生活水平的提高，AP发病率呈逐年上升趋势，尽管近年来针对AP的诊治已取得较大进展，但AP特别是重症AP仍未得到控制，预后仍然较差[2]。因此研究AP发生发展机制是目前研究热点。炎症级联反应参与AP发生发展[3]。研究表明，辅助性T细胞17/调节性T细胞(T helper cell 17/T regulatory cell，Th17/Treg)免疫失衡在AP炎症反应中发挥至关重要的作用[4]。近年越来越多研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)参与AP发生发展[5]。miR-181a-5p是新近发现的miRNA家族成员，有研究通过分析AP患者循环中miRNA表达谱发现，miR-181a-5p在AP患者血清中表达显著下调[6]。然而关于miR-181a-5p在AP患者血清中的表达和功能尚不清楚，本研究就通过检测AP患者血清miR-181a-5p表达，分析其与Th17/Treg免疫平衡的关系，以期为AP防治提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2020年1月至2021年12月我院收治的110例AP患者为AP组，其中男62例，女48例；年龄27～74(46.65±5.88)岁；体质指数18.25～30.65(23.54±1.68)kg/m2；病因：胆源性54例、酒精性25例、高甘油三酯血症性18例、病因不明13例。另选取同期58名体检健康者为对照组，其中男30例，女28例；年龄24～71(45.87±5.17)岁；体质指数18.77～26.32(22.87±1.18)kg/m2；两组一般资料比较无差异(P>0.05)。纳入标准：①AP符合《急性胰腺炎基层诊疗指南(实践版·2019)》[7]诊断标准；②发病至入院时间<48h；③年龄≥18岁；④患者或家属知情并签署同意书。排除标准：①慢性胰腺炎急性发作、外伤性胰腺炎；②妊娠及哺乳期妇女；③合并严重心肝肾和造血系统、免疫系统损害、恶性肿瘤；④近3个月内使用免疫抑制剂和激素。本研究经符合赫尔辛基宣言。

1.2方 法

1.2.1外周血Th17、Treg和相关因子检测 收集AP组入院次日清晨和对照组体检时4mL外周静脉血，分置2管(各2mL)，其中1管3000r/min离心15min(半径10cm)后取上层血清，采用酶联免疫吸附法检测Th17相关因子[白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-17]和Treg相关因子[IL-10、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)]，试剂盒均购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司(编号：E-EL-H0102c、E-EL-H0105c、E-EL-H0103c、E-EL-H0110c)。另1管肝素钠抗凝后，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，于RPMI 1640培养基中调整密度为1×106个/mL。用佛波肉豆蔻醋酸、离子霉素、布雷菲德菌素A处理细胞后，于37℃黑暗环境中孵育5h，获取刺激细胞重悬于PBS中，加入相应抗体后采用赛默飞Attune NxT流式细胞仪通过流式细胞术检测Th17、Treg百分比，并计算Th17/Treg比值。

1.2.2血清miR-181a-5p表达检测:收集AP组入院次日清晨和对照组体检时3mL静脉血，3000r/min离心15min(半径10cm)后取上层血清，Trizol法提取血清总RNA，反转录酶合成cDNA，以cDNA为模板，按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒(上海赫果生物科技有限公司，编号：DRR820A)进行PCR扩增：miR-181a-5p正向引物：5′-AAGATGAGGGTGTTTACG-3′，反向引物：5′-AAGCCTTCTGCCTTAGTT-3′；miR-181a-5p内参U6正向引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向引物：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。反应条件：95℃ 90s，95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 15s，循环40次后收集Ct值，采用2-ΔΔCT法计算血清miR-181a-5p表达。

1.3AP严重程度分组:AP患者入院后48h参考《急性胰腺炎基层诊疗指南(实践版·2019)》[7]评估AP严重程度，根据病情严重程度分为轻症AP组(无并发症和器官功能衰竭)41例、中度重症AP组(有局部或全身并发症，可伴有持续时间<48h的器官功能衰竭)37例、重症AP组(伴有持续时间>48h的器官功能衰竭)32例。

2 结 果

2.1AP组与对照组miR-181a-5p、Th17、Treg比较:与对照组比较，AP组血清miR-181a-5p表达和外周血Treg百分比降低，Th17百分比和Th17/Treg升高(P<0.05)。见表1。

表1 AP组与对照组miR-181a-5p Th17 Treg比较

2.2AP组与对照组Th17、Treg相关因子表达水平比较:与对照组比较，AP组外周血IL-6、IL-17水平升高，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 AP组与对照组Th17 Treg相关因子表达水平比较

2.3不同严重程度AP患者血清miR-181a-5p表达和外周血Th17、Treg百分比比较:轻症、中度重症、重症AP组血清miR-181a-5p表达和外周血Treg百分比依次降低，外周血Th17百分比和Th17/Treg依次升高(P<0.05)。见表3。

表3 不同严重程度AP患者血清miR-181a-5p表达和外周血Th17 Treg百分比比较[M(P25,P75)]

2.4不同严重程度AP患者Th17、Treg相关因子和Th17/Treg比较：轻症、中度重症、重症AP组外周血IL-6、IL-17水平依次升高，IL-10、TGF-β1水平依次降低(P<0.05)。见表4。

表4 不同严重程度AP患者Th17 Treg相关因子和Th17/Treg比较

2.5AP患者血清miR-181a-5p表达与Th17/Treg的相关性 Pearson/Spearman相关性分析显示，AP患者血清miR-181a-5p表达与IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg呈负相关，与IL-10、TGF-β1、Treg呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 AP患者血清miR-181a-5p表达与Th17/Treg的相关性

3 讨 论

AP是多种病因引起胰腺分泌的胰酶在胰腺内异常激活，对胰腺和周围器官产生消化作用而引起的以胰腺局部炎症反应为主要特征的急腹症，尽管临床中80%～85%的AP为轻症，但仍有20%的患者可发展为中度重症甚至重症，重症AP常累及肺脏、肝脏、肾脏、心脏等全身多个器官，病死率高达30%～50%[8]。探索AP发生发展机制有助于早期诊断和提升治疗效果。目前尚不完全明确AP发病机制，但胰腺腺泡细胞内炎症信号通路的持续活化引起腺泡细胞结构破坏、凋亡和坏死在AP发病中扮演重要角色，而随着病情进展炎症又可累及全身多个器官，导致组织结构及功能损害[3]。

目前研究认为，Th17/Treg免疫失衡在AP发生发展中占据主导地位，二者均由Th0细胞分化而来，其中Th17细胞能通过分泌IL-6、IL-17等细胞因子放大炎症，而Treg细胞能通过分泌IL-10、TGF-β1等细胞因子抑制Th17介导的炎症，生理状态下Th17细胞与Treg细胞数量恒定能维持Th17/Treg免疫平衡，当Th17/Treg免疫失衡则会促发炎症反应，进而促进AP发生发展[9]。本研究结果显示，AP患者外周血IL-6、IL-17、Th17百分比、Th17/Treg升高，而IL-10、TGF-β1、Treg百分比降低，说明AP患者Th0细胞明显向Th17细胞分化，Th17/Treg免疫明显失衡。同时结果显示，AP患者外周血IL-6、IL-17、Th17百分比、Th17/Treg随着病情加重而升高，IL-10、TGF-β1、Treg百分比随着病情加重而降低，进一步说明Th17/Treg免疫失衡参与AP发生发展，符合既往研究报道[9]。 目前Th17/Treg免疫平衡成为了AP的研究热点，但关于AP患者Th17/Treg免疫平衡相关的生物标志物报道较少。近年来随着表观遗传学的深入，研究证实表观遗传学参与AP发生发展[10]。miRNA是一个新的表观遗传学中一类新的调控因子，能通过mRNA的3'-非翻译区结合而降解或抑制其翻译而调控基因表达，参与调节细胞增殖、分化、凋亡、炎症等多种生物学功能，在AP发生发展中发挥重要作用。miR-181a-5p是一种高度保守miRNA，定位于人1号染色体前臂32.1处，近年研究发现miR-181a-5p是一个与炎症反应高度相关的miRNA，如miR-181a-5p能靶向抑制高迁移率族蛋白B1缓解神经炎症，能靶向抑制亮氨酸丰富重复FLII相互作用蛋白1抑制肾小球系膜细胞炎症反应[11]。巨噬细胞M1极化是引发AP炎症级联反应的关键因素，有实验发现，miR-181a-5p能靶向抑制高迁移率族蛋白B1抑制AP小鼠巨噬细胞M1极化[12]。这些发现支持我们推测miR-181a-5p参与AP的假设。本研究结果显示，AP患者血清miR-181a-5p表达显著降低，且随着病情加重而降低，提示血清miR-181a-5p低表达可能参与AP发生发展，符合既往研究报道[6]。近期赵萌等[13]临床研究报道，原发免疫性血小板减少症患者外周血miR-181a-5p低表达与Th17/Treg免疫失衡有关。上述研究提示miR-181a-5p低表达与Th17/Treg免疫失衡密切相关，是否与AP中Th17/Treg免疫失衡有关？本研究结果显示，AP患者血清miR-181a-5p表达与IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg呈负相关，与IL-10、TGF-β1、Treg呈正相关，提示miR-181a-5p低表达可能通过Th17/Treg免疫失衡参与AP发生发展。

综上所述，AP患者血清miR-181a-5p表达降低、Th17/Treg免疫失衡，miR-181a-5p可能通过Th17/Treg免疫失衡参与AP发生发展。但本研究仅从血清方面研究了miR-181a-5p与AP患者Th17/Treg免疫平衡的关系，还需进一步实验证实。