阿托品对形觉剥夺性近视模型大鼠的改善作用及作用机制

李锡谦， 康 平， 周 玉

(三六三医院眼科, 四川 成都 611730)

近年来，近视的患病率迅速增加，特别是在东亚和东南亚地区，80%～90%的年轻人患有近视，20%左右的人患有高度近视[1]。高度近视增加眼部并发症的风险，例如视网膜脱离、近视黄斑变性和脉络膜血管新生，甚至导致视力丧失[2]。尽管近视已经非常普遍，但近视发展的机制仍不完全清楚。阿托品(atropine，ATR)是一种非选择性可逆毒蕈碱拮抗剂，在临床上常被用作睫状肌麻痹剂、散瞳剂以及弱视治疗剂[3]。最新研究发现ATR在减缓近视方面具有非常好的效果[4]，然而其作用机制尚不清楚。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路通过调节细胞增殖、分化和遗传稳定性来控制成熟组织的稳态，其异常或突变与人类的多种疾病有关，包括癌症、骨质疏松症、神经变性和心脏代谢疾病[5]。据报道，Wnt/β-catenin信号通路与近视的发生关系密切[6]。而ATR能否通过调控Wnt/β-catenin信号通路对形觉剥夺性近视大鼠起到一定的改善作用尚不明确。因此，本研究旨在探究ATR对形觉剥夺性近视大鼠的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1动物:60只SPF级雄性SD大鼠购自滨州医学院，生产许可证号：SCXK(鲁)2021-0005。本研究已获得本院动物伦理委员会的批准。

1.2主要试剂:ATR购自江苏悦兴药业有限公司；白细胞介素(interleukin，IL)-6(货号：FY-A014251)、IL-1β(货号：FY-A014118)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(货号：FY-A014242)ELISA试剂盒购自上海富雨生物科技有限公司；Wnt/β-catenin通路激活剂TAK-715(货号：S80610)购自上海源叶生物科技有限公司；Wnt(货号：ab260036)、β-catenin(货号：ab32572)、p-β-catenin(货号：ab246504)、TGF-β1(货号：ab215715)、TIMP-2(货号：ab180630)、MMP-2(货号：ab92536)、GAPDH兔多克隆抗体(货号：ab9485)均购自英国Abcam公司。

1.3FDM大鼠模型构建及实验分组:FDM大鼠模型参照文献[6]构建。用胶水把遮光眼罩粘贴在大鼠右眼上，每天检查眼罩是否脱落，若发现眼罩松动，及时用胶水贴好，左眼不做任何处理。NC组大鼠眼睛不做任何处理，共处理4周。将造模成功的48只SD大鼠随机分为Model组、阿托品组(ATR组)、Wnt/β-catenin通路激活剂TAK-715组、ATR+TAK-715组，每组12只。ATR组按照3mg/kg的剂量右眼结膜下注射ATR[7]；TAK-715组按照10mg/kg的剂量右眼结膜下注射TAK-715[8]；ATR+TAK-715组在ATR组基础上右眼结膜下注射10mg/kg TAK-715；NC组、Model组右眼结膜下注射等量的生理盐水，每天一次，持续4周。

1.4标本采集:最后一次注射ATR后，测量大鼠右眼眼轴长度和屈光度，之后麻醉大鼠处死，收集血液，分离得到血清，置于-80℃保存备用。每组取6只大鼠的右眼巩膜固定于4%多聚甲醛中，取剩余6只大鼠右眼巩膜保存在-80℃冰箱。

1.5眼部生物学参数:采用手持带光检影镜测定眼球相对屈光度，A型超声仪测量眼轴长度，评估眼球屈光状态变化。

1.6巩膜形态比较:取巩膜组织置于4%多聚甲醛溶液固定，脱水、包埋、切成5μm的石蜡切片，用苏木精和伊红(H&E)染色后在光学显微镜下观察。

1.7血清炎症因子水平:按照ELISA试剂盒说明书检测血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.8RT-qPCR检测巩膜TGF-β1、MMP-2、TIMP-2 mRNA的表达:提取1.4保存的大鼠巩膜组织总RNA，之后将总RNA反转录为cDNA，采用RT-qPCR测定转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)的mRNA表达量，反应条件为：预变性95℃/30s，40个循环(95℃/5s,60℃/30s)；以GAPDH为内参基因，引物使用NCBI在线设计，见表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.9Western blot检测巩膜组织Wnt/β-catenin通路蛋白表达:取大鼠巩膜组织匀浆，用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，将蛋白质进行变性、定量、电泳、转膜，封闭后分别加入一抗Wnt、β-catenin、p-β-catenin、TGF-β1、TIMP-2、MMP-2和GAPDH抗体(1∶1000)，4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育2h，加入ECL试剂检测蛋白质印迹。使用Image Lab软件分析目标蛋白的灰度值。

2 结 果

2.1ATR对大鼠眼部生物学参数的影响:与NC组相比，Model组右眼眼轴长度和屈光度显著增加(P<0.05)；与Model组相比，ATR组右眼眼轴长度和屈光度显著降低(P<0.05)；TAK-715组右眼眼轴长度和屈光度显著增加(P<0.05)；与ATR组相比，ATR+TAK-715组右眼眼轴长度和屈光度显著增加(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠右眼生物学参数的比较

2.2ATR对大鼠巩膜形态变化的影响:NC组大鼠巩膜厚度正常，胶原纤维排列整齐，细胞外基质分布均匀；与NC组相比，Model组巩膜变薄，胶原纤维排列稀疏紊乱；与Model组比较，ATR组巩膜厚度增加，胶原纤维直径增加；TAK-715组巩膜破碎分离，纤维和细胞质基质之间的空隙增大；与ATR组相比，ATR+TAK-715组巩膜厚度减小，纤维排列紊乱，见图1。

图1 各组大鼠巩膜组织病理变化(HE，×200)

2.3ATR对大鼠血清炎性因子的影响:与NC组相比，Model组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与Model组相比，ATR组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.05)，TAK-715组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与ATR组相比，ATR+TAK-715组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠血清中IL-1β IL-6和TNF-α水平的比较

2.4ATR对大鼠巩膜组织TGF-β1、MMP-2、TIMP-2 mRNA表达的影响:与NC组比较，Model组大鼠巩膜组织TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平显著降低(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平显著升高(P<0.05)；与Model组比较，ATR组大鼠巩膜组织TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平显著升高(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平显著降低(P<0.05)，TAK-715组大鼠巩膜组织TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平显著下降(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平显著升高(P<0.05)；与ATR组相比，ATR+TAK-715组大鼠巩膜组织TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平显著下降(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平显著升高(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠巩膜组织中TGF-β1 MMP-2 TIMP-2 mRNA水平的比较

2.5ATR对大鼠巩膜组织Wnt/β-catenin通路蛋白表达的影响:与NC组比较，Model组大鼠巩膜组织TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平显著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平显著升高(P<0.05)；与Model组比较，ATR组大鼠巩膜组织TGF-β1、TIMP、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平显著升高(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平显著降低(P<0.05)，TAK-715组大鼠巩膜组织TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平显著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平显著升高(P<0.05)；与ATR组相比，ATR+TAK-715组大鼠巩膜组织TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平显著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平显著升高(P<0.05)，见表5，图2。

图2 Western blot检测巩膜组织Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达

表5 各组大鼠巩膜组织中Wnt/β-catenin通路相关蛋白水平的比较

3 讨 论

近视已成为国际公共卫生问题，并给全球造成巨大的经济负担。近视可造成巩膜组织丢失，I型胶原降解增加，以及视网膜萎缩和脉络膜萎缩等变化[9]。本研究结果显示，与NC组比较，Model组大鼠巩膜变薄，胶原纤维排列稀疏紊乱，眼轴长度和屈光度显著增加，表明形觉剥夺性近视大鼠模型构建成功。ATR是从植物颠茄、曼陀罗或莨菪等提出的生物碱，被证明在减缓近视进展方面始终有效[10]。研究[11]发现，0.01% ATR滴眼液可以使近视进展延迟，可能通过抑制巩膜软骨细胞中DNA和糖胺聚糖的合成实现。本研究中，ATR使巩膜厚度增加，胶原纤维直径增加，眼轴长度和屈光度显著降低，与先前的研究一致，验证了ATR对形觉剥夺性近视的改善作用。

眼轴增长为导致近视的重要原因之一，而巩膜外细胞质基质重塑是眼轴增长的重要原因，许多研究表明MMP-2与TIMP-2之间平衡被破坏会导致细胞外基质重塑。TGF-β1可以通过上调TIMP-2表达或调节成纤维细胞与肌成纤维细胞之间的转化，抑制细胞外基质的降解，MMP-2、TIMP-2以及TGF-β1可能是大鼠形觉剥夺性近视的关键调节因子[12]。另外，在近视眼网膜中，IL-6、TNF-α等炎症因子上调，引发促炎级联反应，从而导致眼部炎症[13]。本研究结果显示，Model组大鼠巩膜中存在炎症反应和胞外基质重塑，而ATR组IL-1β、IL-6、TNF-α水平和MMP-2 mRNA水平和蛋白水平显著降低，TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平以及蛋白水平显著升高，表明ATR可能通过减轻炎症反应、抑制胞外基质重塑，对形觉剥夺性近视大鼠起到保护作用。

研究报道称Wnt/β-catenin信号通路参与调控炎症反应、纤维化和血管新生等生理病理过程，其异常或突变与近视密切相关，Wnt/β-catenin通路的活化通过调节巩膜重塑，参与形觉剥夺性小鼠近视进展[14]，而Wnt信号通路拮抗剂DKK-1可减少屈光不正者的近视转移[15]。本研究中，与Model组比较，ATR组大鼠Wnt蛋白水平显著降低、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平显著升高，提示ATR可抑制形觉剥夺性近视大鼠巩膜组织中Wnt/β-catenin信号通路的活化。为了验证该推测，本研究利用Wnt/β-catenin信号通路激活剂干预发现，与ATR组相比，ATR+TAK-715组巩膜损伤加重，IL-1β、IL-6、TNF-α水平、MMP-2 mRNA水平及MMP-2、Wnt蛋白水平显著增加，TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平显著降低。表明TAK-715可减弱ATR对形觉剥夺性近视大鼠的保护作用，证实了ATR确实可能通过抑制Wnt/β-catenin通路，改善大鼠形觉剥夺性近视。

综上所述，ATR可能通过抑制Wnt/β-catenin通路减轻炎症反应，抑制胞外基质重塑，进而改善大鼠形觉剥夺性近视。然而，ATR调控大鼠形觉剥夺性近视可能涉及其他通路，有待深入探究。