氟伐他汀钠通过下调lncRNA PTPRG-AS1表达对结直肠癌SW620细胞增殖凋亡的影响

刘 芝， 董丽娥， 陈 斌， 陈子鑫

(1.四川省绵竹市人民医院， 四川 绵竹 618200 2.中国人民解放军西部战区总医院药剂科， 四川 成都 610083)

结直肠癌是发病率、死亡率分别居全球恶性肿瘤排行第三、第五的消化系统恶性肿瘤，其治疗方法主要有手术、放疗、化疗等[1]。近年来，结直肠癌治疗有了较大进展，但因当前化疗药物副作用大、肿瘤细胞易耐药[2]，治疗效果仍不令人满意，因此，仍需要寻找治疗结直肠癌的新药物或新方法。氟伐他汀是常见的他汀类药物，临床主要用于治疗高脂血症。Ishikawa等[3]报道称，氟伐他汀可能通过下调zeste同源物2介导的p27表达抑制结直肠癌细胞增殖，发挥一定抗结直肠癌作用，但其作用机制仍不明确。蛋白酪氨酸磷酸酶受体D反义RNA1(PTPRG-AS1)是一种在食管鳞癌、上皮性卵巢癌、肝癌中表达增加的长链非编码RNA(lncRNA)，敲减lncRNA PTPRG-AS1抑制肿瘤细胞恶性行为，可作为肿瘤治疗的分子靶点[4～6]。本研究在前期实验中发现，lncRNA PTPRG-AS1在结直肠癌SW620细胞中表达显著高于正常结直肠上皮FHC细胞，推测lncRNA PTPRG-AS1可能也作为促癌基因参与结直肠癌的发展进程。本研究主要探究氟伐他汀钠和lncRNA PTPRG-AS1对结直肠癌SW620细胞增殖、凋亡的影响，并探究氟伐他汀钠能否调控lncRNA PTPRG-AS1影响SW620细胞增殖、凋亡，以期为其用于结直肠癌的治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂：正常结直肠上皮FHC细胞购自上海沪震生物科技有限公司；结直肠癌SW620细胞购自宁波明舟生物科技有限公司；氟伐他汀钠购自上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；qRT-PCR实验相关试剂盒购自大连宝生物；RPMI 1640培养液、LipofectamineTM 2000试剂盒、CCK-8试剂盒、RIPA裂解液、Annexin V-FITC/PI试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；兔抗人一抗[活化的半胱天冬酶(cleaved-caspases)-3、cleaved-caspase9、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)]、山羊抗兔二抗(辣根过氧化酶标记)购自英国Abcam公司。

1.2细胞培养：复苏SW620、FHC细胞，均用含10 %胎牛血清的RPMI 1640培养液于CO2培养箱中培养。

1.3qRT-PCR检测lncRNA PTPRG-AS1表达：于6孔板(1.0×105个/孔)培养SW620、FHC细胞24h，弃培养液，收集细胞。提取细胞中总RNA，逆转录为cDNA，行PCR扩增。引物序列：lncRNA PTPRG-AS1上游5'-AAG CCA AGC AGT CAG AAG CA-3'，下游5'-GAG CCC TGA CAG CCT AAT GA-3'；GAPDH上游5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'，下游5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'。2-△△Ct法计算lncRNA PTPRG-AS1相对GAPDH表达量。

1.4SW620细胞转染和分组：于6孔板(1.0×105个/孔)培养SW620细胞24h，利用LipofectamineTM 2000试剂盒分别转染si-PTPRG-AS1、si-NC、pcDNA-PTPRG-AS1、pcDNA，转染12h后，检测细胞中lncRNA PTPRG-AS1表达，验证转染效果。未转染的SW620细胞分为对照组(常规培养)、氟伐他汀钠-低、中、高组(分别用5、10、20μmoL/L[7]氟伐他汀钠孵育)；转染si-PTPRG-AS1、si-NC的SW620细胞处理同对照组，记为si-PTPRG-AS1组、si-NC组；转染pcDNA-PTPRG-AS1、pcDNA的SW620细胞处理同氟伐他汀钠高组，记为氟伐他汀钠+pcDNA-PTPRG-AS1组、氟伐他汀钠+pcDNA组。

1.5CCK-8法检测细胞活性：于96孔板(5.0×104个/孔)接种未转染、转染后的SW620细胞并培养12h，然后按照上述1.4分组培养，分别培养24、48、72h。加CCK-8(10μL/孔)，孵育2h，酶标仪(450 nm)测各孔吸光度(A)值。A值越大，说明细胞活性越强。

1.6克隆形成实验：于6孔板(1.0×104个/孔)接种未转染、转染后的SW620细胞并培养12h，然后按照上述1.4分组培养，培养14d。弃培养液，将细胞用多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜观察，计数。

1.7流式细胞仪检测细胞凋亡：于6孔板(1.0×104个/孔)接种未转染、转染后的SW620细胞并培养12h，然后按照上述1.4分组培养，培养24h。弃培养液，收集各组细胞。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2次，300×g离心5min，吸弃PBS。向细胞沉淀中加Binding Buffer，重悬细胞，并调整细胞密度为1.0×106个/mL。取100μL细胞悬液，依次加10μL Annexin V-FITC、5μL PI，避光孵育15min，于1h内于流式细胞仪中检测细胞凋亡率。

1.8Western blot法检测蛋白表达：用RIPA裂解液提取各组细胞中总蛋白，BCA法测蛋白浓度。行SDS-PAGE实验分离总蛋白，转至PVDF膜，并用5%脱脂奶粉封闭2h。先置于一抗[cleaved-caspase3(1∶500)、cleaved-caspase9(1∶500)、GAPDH(内参，1∶1 000)]孵育液4℃孵育12h，再于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中室温孵育1h。显影，曝光拍照，ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1lncRNA PTPRG-AS1在结直肠癌SW620细胞中的表达：正常结直肠上皮FHC细胞、结直肠癌SW620细胞中lncRNA PTPRG-AS1表达量分别为1.00±0.00、4.38±0.31，两组间比较差异有统计学意义(t=18.885，P<0.05)。

2.2氟伐他汀钠对结直肠癌SW620细胞增殖的影响：氟伐他汀钠-低、中、高组细胞活性、克隆形成数均低于对照组(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表1。

表1 氟伐他汀钠对SW620细胞增殖的影响

2.3氟伐他汀钠对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响：氟伐他汀钠-低、中、高组细胞凋亡率、凋亡相关蛋白(cleaved-caspase3、cleaved-caspase9)表达均高于对照组(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1、表2。

图1 氟伐他汀钠对SW620细胞凋亡的影响A：氟伐他汀钠对SW620细胞凋亡相关蛋白表达的影响；B：氟伐他汀钠对SW620细胞凋亡的影响

表2 氟伐他汀钠对SW620细胞凋亡的影响

2.4氟伐他汀钠对结直肠癌SW620细胞lncRNA PTPRG-AS1表达的影响：对照组、氟伐他汀钠-低、中、高组lncRNA PTPRG-AS1表达量分别为1.00±0.00、0.77±0.06、0.58±0.04、0.36±0.04，四组间比较差异有统计学意义(F=131.103，P<0.05)。氟伐他汀钠-低、中、高组lncRNA PTPRG-AS1表达量均低于对照组(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)。

2.5下调lncRNA PTPRG-AS1表达对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响：lncRNA PTPRG-AS1在转染si-PTPRG-AS1的SW620细胞中的表达量为0.28±0.03，较转染si-NC的SW620细胞中表达量(1.00±0.00)降低，差异有统计学意义(t=41.569，P<0.05)，说明转染si-PTPRG-AS1下调SW620细胞中lncRNA PTPRG-AS1表达。si-PTPRG-AS1组细胞活性、克隆形成数均低于si-NC组(P<0.05)，细胞凋亡率、凋亡相关蛋白(cleaved-caspase3、cleaved-caspase9)表达均高于si-NC组(P<0.05)。见图2、表3。

图2 下调lncRNA PTPRG-AS1对SW620细胞凋亡的影响A：下调lncRNA PTPRG-AS1对SW620细胞凋亡相关蛋白表达的影响；B：下调lncRNA PTPRG-AS1对SW620细胞凋亡的影响

表3 下调lncRNA PTPRG-AS1对SW620细胞增殖和凋亡的影响

2.6上调lncRNA PTPRG-AS1表达逆转氟伐他汀钠(20μmoL/L)对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用：lncRNA PTPRG-AS1在转染pcDNA-PTPRG-AS1的SW620细胞中的表达量为3.36±0.34，较转染pcDNA的SW620细胞中表达量(1.00±0.00)升高，差异有统计学意义(t=12.022，P<0.05)，说明转染pcDNA-PTPRG-AS1上调SW620细胞中lncRNA PTPRG-AS1表达。氟伐他汀钠+pcDNA-PTPRG-AS1组细胞活性、克隆形成数均高于si-NC组(P<0.05)，细胞凋亡率、凋亡相关蛋白(cleaved-caspase3、cleaved-caspase9)表达均低于氟伐他汀钠+pcDNA组(P<0.05)。见图3、表4。

表4 上调lncRNA PTPRG-AS1逆转氟伐他汀钠对SW620细胞增殖和凋亡的作用

图3 上调lncRNA PTPRG-AS1逆转氟伐他汀钠对SW620细胞凋亡的作用A：上调lncRNA PTPRG-AS1逆转氟伐他汀钠对SW620细胞凋亡相关蛋白表达的作用；B：上调lncRNA PTPRG-AS1逆转氟伐他汀钠对SW620细胞凋亡的作用

3 讨 论

结直肠癌发病率随着居民饮食习惯、饮食结构的改变呈增长趋势，严重危害居民生命安全。肿瘤细胞异常增殖是结直肠癌发生发展的主要原因，诱导结直肠癌细胞凋亡是该肿瘤治疗的主要途径，因此，寻找抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡的药物，可能为结直肠癌的治疗提供新途径。

他汀类药物可竞争性抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，且具有高度专一性，是临床治疗高血脂症的常用药物。近年来，体外细胞实验显示，他汀类药物可抑制肺癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞的恶性行为，具有抗肿瘤作用[8,9]。氟伐他汀是他汀类药物中的一种常见类型，其可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路阻碍皮肤鳞癌细胞增殖并促进细胞凋亡，还可通过上调SIRT6表达抑制子宫内膜癌细胞侵袭、增殖和迁移，发挥抗皮肤鳞癌、子宫内膜癌作用[7,10]。本实验结果显示，氟伐他汀钠对结直肠癌细胞增殖具有显著抑制作用，且促进细胞凋亡，与Ishikawa等[3]报道结果一致，提示氟伐他汀钠有治疗结直肠癌的潜在价值。肿瘤细胞凋亡是一种程序性死亡过程，受多种基因分子和信号通路调控。caspase9和caspase3是caspase级联反应的重要参与者，被活化后传递凋亡信号，诱导细胞凋亡。本实验结果提示，氟伐他汀钠促进结直肠癌细胞中caspase9和caspase3活化，这也可能是其诱导结直肠癌细胞凋亡的原因之一。

lncRNA广泛表达于真核生物中，其异常表达与结直肠癌发生发展息息相关，可作为结直肠癌治疗的分子靶点[11,12]。研究显示，lncRNA PTPRG-AS1在骨肉瘤组织和细胞中呈高表达，敲低lncRNA PTPRG-AS1对骨肉瘤细胞侵袭和迁移起抑制作用，lncRNA PTPRG-AS1可作为骨肉瘤治疗的分子靶点[13]；lncRNA PTPRG-AS1在鼻咽癌细胞中表达上调，其通过发挥miR-194-3p“海绵”作用上调PRC1表达，进而促进鼻咽癌细胞侵袭、迁移、增殖及放疗抗性，敲减lncRNA PTPRG-AS1可能改善鼻咽癌治疗效果[14]。本实验数据显示，lncRNA PTPRG-AS1在结直肠癌细胞中表达升高，下调lncRNA PTPRG-AS1抑制结直肠癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡，与lncRNA PTPRG-AS1对骨肉瘤、鼻咽癌细胞恶性行为的影响一致，提示lncRNA PTPRG-AS1作为促癌因子参与结直肠癌的发生发展，下调lncRNA PTPRG-AS1有利于减缓结直肠癌的发展进程。本研究还显示，氟伐他汀钠呈剂量依赖性抑制结直肠癌细胞中lncRNA PTPRG-AS1表达，而上调lncRNA PTPRG-AS1逆转了氟伐他汀钠对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响，提示氟伐他汀钠可能通过下调lncRNA PTPRG-AS1发挥抗结直肠癌作用。

综上，氟伐他汀钠抑制结直肠癌细胞增殖，并促进细胞凋亡，具有抗结直肠癌作用，其作用机制可能与下调lncRNA PTPRG-AS1表达有关。但是，lncRNA通常发挥miRNA“海绵”作用影响靶基因表达，进而发挥生物学调控功能，因此，氟伐他汀钠作用的lncRNA PTPRG-AS1下游miRNA和靶基因还有待探究；同时，本研究尚未在体内探究氟伐他汀钠抗结直肠癌的作用，这是本文的不足之处，也是接下来要进行的研究内容。