茶黄素调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对膝骨关节炎大鼠的治疗作用

郭文帆， 杨学钰， 郑雪君， 卢吉高， 杨 勇, 李会东

(河北省张家口市第二医院运动医学科， 河北 张家口 075000)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一种慢性退行性关节疾病，是老龄化社会中导致老年人膝关节疼痛、功能下降和残疾的常见原因。KOA的病理生理机制十分复杂，现阶段已发现炎症在KOA的发病机制中起关键作用，其有助于KOA疼痛的发生[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)通路在协助细胞存活抑制炎症和细胞凋亡以及刺激抗氧化剂合成方面起着不可或缺的作用，此外，上调SIRT1表达可通过靶向抑制核因子-κB(NF-κB)乙酰化进而抑制促炎因子的表达[2]。已研究发现红花黄可通过调节AMPK/SIRT1/NF-κB通路改善TNF-α 诱导的软骨细胞炎症[3]。茶黄素是红茶发酵过程产生的一种多酚物质，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用[4]。并且已有研究发现茶黄素可以抑制原代小鼠软骨细胞中由叔丁基过氧化氢 (TBHP) 引起的合成代谢和分解代谢失衡，并可通过Keap1/Nrf2/HO-1轴改善软骨细胞凋亡和衰老水平，此外，口服茶黄素还可改善骨关节炎(OA)小鼠骨关节炎的发展[5]。但对于茶黄素对KOA的治疗作用尚无有报道，本研究通过向大鼠右膝关节注射碘乙酸钠(MIA)建立KOA大鼠模型，探讨茶黄素对KOA大鼠的治疗作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料:76只雄性SD大鼠，(200±20)g，购自北京华益健康药物研究中心，许可证号：SYXK(京)2019-0035。 将动物饲养在温度(22±2)℃、湿度(60-80)%和12h/12h明暗交替的房间内，自由饮食饮水。

1.2实验试剂:茶黄素(B20140)购自上海源叶生物科技有限公司；塞来昔布胶囊(H20213717，0.2g)购自北大医药股份有限公司；AMPK抑制剂Compound C( HY-13418A)购自MCE公司；IL-1β(RA20422)、TNF-α(RA20035)和COMP(RA20863)ELISA试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；SOD(A001-3-2)和MDA(A003-1-2)试剂盒购自南京建成；抗体AMPKα(ab32047)、NF-κB p65(ab32536)、SIRT1(ab110304)、GAPDH(ab8245)和辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的二抗(ab6721)购自英国abcam公司。p-NF-κB p65(PA5-118566)、p-AMPKα(PA5-104982)购自Theremo Fisher公司。

1.3造模与分组:76只大鼠取13只作为空白组，其余大鼠通过0.3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，于右膝关节注射50μL，浓度为0.01mg/μL的MIA，空白组注射等量的生理盐水[6]。两周后观察大鼠行为学变化，并从空白组和造模大鼠中随机抽取3只，HE染色观察右侧膝关节软骨的病理变化，使用Mankin和lequesne MG评分确定造模成功与否，当Mankin 和lequesne MG评分显著升高时，表示造模成功。Mankin 评分标准为：评分系统评估软骨表面损伤(0～6分)、细胞性丧失(0～3分)、基质染色丧失(0～4分)、潮痕完整性丧失(0～1分)；lequesne MG评分标准见表1。将剩余造模成功的60只大鼠随机分为6组：模型组、茶黄素低剂量组(20mg/kg)、茶黄素中剂量组(40mg/kg)、茶黄素高剂量组(80mg/kg)、塞来昔布组(阳性药，18mg/kg(根据临床有效剂量折算))、抑制剂组，每组10只。剩余10只为空白组。除空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水，茶黄素低、中、高剂量组以及塞来昔布组分别灌胃相应剂量的药物。抑制剂组除给予80mg/kg茶黄素外需尾静脉注射0.2mg/kg AMPK抑制剂Compound C(根据购买说明书给药)，其余组尾静脉注射等体积生理盐水，每天给药一次，连续给药4周。给药4周后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血，室温静置1h后离心收集血清，-20℃保存备用。取右侧膝关节软骨，表型观察其病理改变，一半经多聚甲醛固定24h后使用10%乙二胺四乙酸脱钙后脱水包埋。另一半放入-80℃中备用。

表1 lequesne MG评分

1.4大鼠机械疼痛阈值检测:大鼠适应性喂养后1天记为第1天。大鼠机械疼痛阈值检测在第15天(造模后1天)，第29天(给药第14天)和第43天(给药第28天)进行。大鼠在金属笼中适应30min后使用不同弯曲力的细丝刺激大鼠右肢足底二、三跖骨处，出现缩足反应时记录为阳性，当记录为阴性时，呈对数递增刺激力度。初始刺激力度为2.0g，刺激时间为 8s，每只大鼠连续刺激3次，间隔为30s。记录产生阳性反应的最小刺激强度为机械疼痛阈值。

1.5测量大鼠关节宽度并观察大鼠行为学变化:在第15天、29天和43天时使用游标卡尺测量大鼠膝关节宽度，评估关节肿胀程度，并观察大鼠行为学变化，给药结束后1天进行lequesne MG评分。

1.6苏木精-伊红 (HE) 染色观察大鼠膝关节软骨病理学变化:大鼠膝关节软骨脱钙后，脱水、石蜡包埋，之后进行HE染色，于光学显微镜下观察病理变化，并进行Mankin 评分。

1.7ELISA法测定血清炎症因子(IL-1β 、 TNF-α 和COMP):取各组大鼠血清，通过使用各自ELISA试剂盒检测血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.8WST-1法和硫代巴比妥酸法分别检测氧化应激标志物SOD和MDA水平:1.7剩余血清通过使用WST-1法和硫代巴比妥酸法分别检测大鼠血清SOD和MDA水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.9Western Blot检测蛋白表达:取大鼠膝关节软骨提取总蛋白，BCA测定总蛋白浓度。使用SDS-PAGE分离目的蛋白，并转移至PVDF膜上，经5%脱脂奶粉封闭后与一抗p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65和GAPDH在4℃下孵育过夜，后与二抗室温孵育1h，加入ECL显色观察蛋白条带，Image J软件评估蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠造模成功评判:与空白组相比，造模大鼠Mankin和lequesne MG评分显著升高，HE染色显示造模大鼠染色不均匀，细胞排列紊乱，表面粗糙，排列不均匀，软骨细胞数量减少，潮痕不明显，显示造模成功，见表2。

表2 各组大鼠软骨组织Mankin和lequesne MG评分

2.2各组大鼠疼痛阈值及关节宽度变化情况:与空白组相比，第15天时，模型组、茶黄素低、中、高剂量组、塞来昔布组和抑制剂组大鼠疼痛阈值显著降低，关节宽度显著增加(P<0.05)；与模型组相比，第29天和第43天，茶黄素低、中、高剂量组以及塞来昔布组大鼠疼痛阈值显著升高，关节宽度减少(P<0.05)；与茶黄素高剂量组相比，抑制剂组大鼠疼痛阈值显著降低，关节宽度增加(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠疼痛阈值及关节宽度变化情况

2.3各组大鼠软骨组织的病理形态学观察:空白组大鼠软骨结构完整，足底正常，各骨层HE染色清晰均匀，表面光滑无裂隙，软骨细胞分布均匀，无聚集；模型组软骨层较薄，大鼠足底肿胀，HE染色不均匀，细胞排列紊乱，表面粗糙，排列不均匀，软骨细胞数量减少，潮痕不明显；茶黄素低、中、高剂量组以及塞来昔布组大鼠足底肿胀较模型组明显减轻，软骨表面损伤轻微，染色更均匀，软骨细胞可见；抑制剂组较茶黄素高剂量组软骨细胞数量较少，表面较粗糙，染色不均匀。各组Mankin和lequesne MG评分显示，与空白组相比，模型组Mankin和lequesne MG评分显著升高(P<0.05)；与模型组相比，茶黄素低、中、高剂量组以及塞来昔布组大鼠Mankin和lequesne MG评分显著降低(P<0.05)，而抑制剂组Mankin和lequesne MG评分高于茶黄素高剂量组(P<0.05)，见图1和表4。

图1 各组大鼠HE染色病理观察(×200)

表4 各组大鼠软骨组织Mankin和lequesne MG评分

2.4各组大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP、MDA、SOD水平:与空白组相比，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均显著升高，SOD水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，茶黄素低、中、高剂量组和塞来昔布组IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均显著降低，SOD水平显著升高(P<0.05)；与茶黄素高剂量组相比，抑制剂组大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均显著升高，SOD水平显著降低(P<0.05)，见表5和表6。

表5 各组大鼠血清IL-1β TNF-α和COMP水平

表6 各组大鼠血清MDA和SOD水平

2.5各组大鼠p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达情况:与空白组相比，模型组大鼠p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表达水平均显著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，茶黄素低、中、高剂量组和塞来昔布组p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表达水平均显著升高，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平显著降低(P<0.05)；与茶黄素高剂量组相比，抑制剂组p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表达水平均显著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平显著升高(P<0.05)，见图2和表7。

表7 各组大鼠p-AMPKα AMPKα SIRT1 p-NF-κB p65 NF-κB p65蛋白表达

图2 各组大鼠p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达注：A：空白组；B：模型组；C：茶黄素低剂量组；D：茶黄素中剂量组；E：茶黄素高剂量组；F：塞来昔布组；G：抑制剂组

3 讨 论

KOA的主要病理是关节软骨、软骨下骨和关节部位软组织中不可逆的退行性改变。本研究通过将MIA注射到大鼠膝关节诱导大鼠KOA模型，该模型与人类骨关节炎相关的疼痛和生化/结构变化最为相似[6]。向大鼠膝关节注射MIA两周后，大鼠膝关节HE染色不均匀，细胞排列紊乱，表面粗糙，排列不均匀，软骨细胞数量减少，潮痕不明显，且Mankin和lequesne MG评分显著升高，显示造模成功。COMP的浓度已被证明是关节炎早期软骨病变的候选指标[7]。此外，认为减轻氧化应激能有效改善KOA症状，已报道，SOD水平与KOA疾病严重程度呈负相关，而MDA水平与疾病严重程度呈正相关[8]。本研究探讨了茶黄素对KOA大鼠的治疗作用。结果表明茶黄素低、中、高剂量组可显著升高KOA大鼠疼痛阈值和SOD水平，减小大鼠关节宽度，降低Mankin和lequesne MG评分COMP和MDA水平，另外还可改善KOA大鼠足底肿胀，使HE染色更均匀，软骨细胞增多，表面损伤减轻。表明茶黄素可以改善KOA大鼠的关节疼痛并对KOA大鼠具有治疗作用。

AMPK是一种广泛表达且高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被称为细胞能量传感器，能够抑制氧化应激和炎症[9]。AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路在炎症发生过程中其重要作用，SIRT1的激活依赖于AMPK，AMPK上调SIRT1的蛋白表达，并在病理条件下抑制炎症，此外，SIRT1也通过抑制其下游靶点NF-κB进而减少促炎细胞因子(例如，IL-1β和TNF-α)的分泌，在抗炎中发挥作用。由于炎症因子在KOA软骨的破坏性改变和对软骨骨结构变化的修饰中起重要作用，并会加重疼痛反应，因此，减少促炎细胞因子的产生(IL-1β和TNF-α)是治疗KOA最重要的目标[10]。另外，已有研究发现儿茶素可通过AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路抑制TNF-α诱导的3T3-L1脂肪细胞促炎细胞因子(IL-1α，IL-1β，IL-6)的产生而减弱炎症的发生[11]。本研究结果发现茶黄素可以增加AMPKα磷酸化、SIRT1表达水平，降低IL-1β、TNF-α的分泌以及NF-κB p65蛋白磷酸化水平，提示茶黄素可通过AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路抑制KOA大鼠炎症进而发挥对KOA大鼠的治疗作用。随后加入AMPK抑制剂Compound C经验证，发现抑制剂组可减弱茶黄素对KOA大鼠的治疗作用，因此证实，茶黄素通过调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对KOA大鼠起治疗作用。

综上所述，茶黄素对KOA大鼠具有明显的治疗作用，其通过激活AMPK和SIRT1蛋白水平，抑制NF-κB水平，减轻炎症和氧化应激反应。证明AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路可作为治疗KOA的新靶标，但其具体作用机制还需进一步深入研究。