滋膵通脉饮通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路减轻高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的实验研究

吴刚强， 袁春云， 袁思斯， 毛 叶， 陈 琪，温小凤， 谭 军， 卜献春

(1.湖南省中医药研究院附属医院老干科/全国名老中医药专家卜献春传承工作室, 湖南 长沙 410006 2.湖南省中医药研究院附属医院药剂科, 湖南 长沙 410006 3.湖南中医药大学第二附属医院心血管内科, 湖南 长沙 410005)

糖尿病是目前全人类需要共同面对的一个重大健康问题。糖尿病心肌病以糖尿病患者的心肌细胞坏死和凋亡为特征。研究显示，糖尿病会引起心脏自噬抑制，其在糖尿病心肌病的发病机制中占有一席之地，而增强自噬能在糖尿病心肌病中形成保护心脏的作用，减少心脏组织细胞凋亡，改善心脏损伤[1]。近年来PI3K-Akt-mTOR信号通路被认为是自噬调节中唯一的抑制性通路，在自噬调控中发挥重要作用。研究显示，调节PI3K-Akt-mTOR信号通路可激活自噬，减轻心肌损伤[2]。因此，PI3K/Akt/mTOR-自噬作为一种关键性的自我调节机制对糖尿病心肌细胞凋亡起着极其重要的作用。虽然越来越多的药物被循证医学证明治疗糖尿病心肌病疗效显著，但糖尿病心肌病的高发病率和高死亡率仍然困扰着广大临床医务工作者。中医药治疗糖尿病疗效确切，具有毒副作用小，价格低廉，患者依从性好。课题组根据前期临床与实验研究表明，应用益气养阴、活血通络的滋膵通脉饮治疗糖尿病心肌病取得了令人满意的结果[3,4]。本研究结合课题组前期开展的研究，拟从PI3K-Akt-mTOR信号通路的角度，探究滋膵通脉饮含药血浆对高糖诱导下的心肌细胞自噬和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1药物、试剂与主要仪器:LC3-Ⅱ抗体(货号：18725-1-AP，美国proteintech)，PI3K 抗体(货号：bs-0128R，博奥森),P-Akt 抗体(货号：66444-1-Ig，美国proteintech),mTOR(货号：bs-1992R，博奥森),caspase-3抗体(货号：ab184787，英国abcam)，GAPDH抗体(货号：10494-1-AP，美国proteintech)，HRP goat anti-mouse IgG抗体(货号：SA00001-1，美国proteintech)，HRP goat anti-rabbit IgG抗体(货号：SA00001-2，美国proteintech)，1.0moL/L Tris·HCl(pH6.8)(货号：AWB0074，中国abiowell)，10%APS(货号：AWB0093，中国abiowell)，10%SDS(货号：AWT0047，中国abiowell)，TEMED(货号：AWB0068，中国abiowell)，PBST 缓冲液(货号：AWI0130，中国abiowell)，30%Acr/Bic(货号：AWB0020，中国abiowell)，电泳液缓冲液(货号：AWB0083，中国abiowell)，RIPA裂解液(货号：AWB0136，中国abiowell)，蛋白酶抑制剂(货号：583794，中国北京金泰宏达)，蛋白磷酸酶抑制剂(货号：AWH0650，中国abiowell)，胰酶消化液(货号：AWC0232，abiowell)，胎牛血清(FBS)(货号：10099141，Gibco)，细胞冻存液(货号：AWC0229，abiowell)，凋亡试剂盒(APC)(货号：KGA1030，凯基生物)，Rapamycin(货号：A8167，ApexBio)，摇床(货号：TS-92，其林贝尔)，显微镜(货号：BA210T，Motic)。

1.2制备含药血浆:20只SD大鼠，随机分为两组，空白血浆组、滋膵通脉饮组，每组10只。按临床上5倍成人(70kg)剂量给药。滋膵通脉饮主要由黄芪、生地黄、山茱萸、玄参、天花粉、麦冬、生蒲黄、全蝎、水蛭、地龙、僵蚕、丹参、山楂、川芎、鬼箭羽等药物组成，以上药材均从湖南省中医药研究院附属医院门诊中药房购得。药物浓度为4.4g/mL，灌胃量为10mL·kg-1·d-1；空白血浆组采用等剂量的灭菌超纯水灌胃(给药体积为10mL/kg)。连续灌胃7d，所有大鼠采血前12h禁食不禁水，最后一次灌胃1h后麻醉，进行腹主动脉采血，用1.5%的EDTA-Na2对采得的血液进行抗凝处理后，离心取血浆，首先使用0.22μm滤膜过滤血浆，然后在56℃恒温水浴锅中对其灭活30min，最后分装至无菌EP管中，放置在-80℃冰箱里保存备用。

1.3CCK-8法筛选含药血浆浓度:把接种在细胞培养板(96孔)上的生长状态良好的H9c2心肌细胞分为正常组、空白血浆组和含药血浆组。正常组用完全培养液，各组分别设10个复孔，加入细胞悬液(100μL/孔)。把以上各组放入恒温培养箱(37℃、5% CO2)中过夜进行预培养处理后，分别加入胎牛血清，空白血浆和含药血浆，每组均设置5%、10%、15%的浓度梯度。均置于恒温培养箱(37℃、5% CO2)中培养24h。经培养后，各孔中滴加10μL的CCK-8，继续培养2h，检测各孔在450nm处的OD值。

1.4细胞培养和处理:H9c2细胞培养于含10%FBS+1%双抗的DMEM中，37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。取对数生长的细胞铺板在96孔板里面，待细胞贴壁后分为A(正常组)、B(模型组)、C(模型+中药含药血浆组)、E(模型+恩格列净组)。正常组：细胞正常培养；模型组：细胞加33.3mmoL/L的 D-葡萄糖+ 15%的空白血浆；模型+滋膵通脉饮含药血浆组：细胞加33.3mmoL/L的 D-葡萄糖+10%含中药含药血浆；模型+恩格列净组：细胞加33.3mmoL/L的 D-葡萄糖+0.01umoL/L恩格列净，培养24h后收集细胞。

1.5免疫荧光染色(IF)检测LC3B在H9C2心肌细胞的表达:取出细胞爬片，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次；加入0.3%曲拉通，37℃、30min进行细胞膜通透，PBS漂洗3次；用5%BSA、37℃封闭60min，PBS冲洗3次；滴加经过适当稀释的一抗(LC3B)4℃过夜进行一抗的孵育，PBS冲洗3次；再滴加50～100μL抗-Rabbit-IgG标记荧光抗体，37℃孵育90min完成二抗的孵育，PBS漂洗3次；使用DAPI工作液37℃、10min进行复染核，PBS冲洗3次；缓冲甘油封片(注意避光保存)。利用荧光显微镜实施观察分析及采集图像。

1.6免疫印迹(Western Blot)法检测H9c2心肌细胞中PI3K、P-Akt、mTOR、caspase-3的蛋白表达:蛋白提取：①用冰预冷PBS洗涤细胞一次，加入200μL RIPA裂解液，用细胞刮刀刮下细胞，收集悬液，超声破碎1.5min；②冰上，裂解10min；③4℃，12000 rpm离心 15min；④将离心后的上清转移倒 1.5mL的离心管中。蛋白浓度检测：①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。②完全溶解蛋白标准品，浓度为2mg/mL。标准品用RIPA裂解液按照50%梯度稀释。③将各梯度稀释标准品和空白样每样25μL加到96孔板的标准品孔中。④将25μL的样品加入到96孔板的样品孔中。⑤将200μL BCA工作液加入到各孔中，37℃温度下放置30min。在550 nm波长出测定吸光值。根据标准曲线水平计算蛋白的浓度。Western Blot：①制胶：a制备10%的分离胶，加入 TEMED后摇匀,后即可灌胶。灌胶后，再用异丙醇封胶；b当微微倾斜制胶器分界线不再变化时，说明胶已凝了。再等 3min 左右,当胶充分凝固后,去除胶上层异丙醇,并用滤纸充分吸干。C制备4.8%的浓缩胶，加入 TEMED后充分摇匀,后即可进行灌胶。将梳子插入到玻璃板中，剩余的空间即可灌满浓缩胶，待胶凝固后即可。②样品准备：取100μL蛋白上清，加入25μL 5*loading buffer混匀，沸水煮5min，放入冰盒中速冷备用。③电泳：a根据蛋白定量的结果，再第一个孔点加入marker 2μL，其余每孔加入10～20μL已变性的蛋白。b开始电泳，电泳恒定电压75V，时间为130min。待溴酚蓝电泳至胶底部时即可终止电泳。④转膜：a按照切全膜。b准备6张大小与胶相同的滤纸和1张NC膜，NC膜与滤纸一同放入到转膜缓冲液中，使其完全浸透。c按照滤纸，NC膜，胶，滤纸的顺序依次放好，中间排除气泡。d盖上仪器，接通电源，300mA恒定电流转膜，各指标转膜时间见抗体信息。d转膜完毕后，将膜取出放入PBST中清洗1次。⑤封闭：用1*PBST配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置90min；⑥一抗孵育：a用PBST将一抗按照一定比例稀释，将膜与一抗一起孵育，4℃过夜，次日室温放置30min；b孵育结束，1*PBST洗3次，每次10min。⑦二抗孵育：a用1*PBST稀释HRP标记的二抗(具体比列见下表)，将稀释后的二抗与膜共同室温孵育90min；b孵育结束，1*PBST清洗3次，每次大约15min。⑧显色/曝光：ECL显色曝光：使用ECL化学发光液与膜孵育1min，用滤纸吸尽液体，用塑封膜将膜包裹杂交膜，凝胶系统成像。

1.7统计学处理:利用SPSS 21.0统计学软件处理相关的数据。多组比较用one-way ANOVA分析，显著性水平α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同浓度的滋膵通脉饮含药血浆对H9c2心肌细胞的影响:运用CCK-8法检测滋膵通脉饮含药血浆对H9c2心肌细胞增殖的影响，结果显示：同正常组比较，浓度为10%的滋膵通脉饮含药血浆及空白血浆组OD值差异无统计学意义(t=0.1910，P=0.8513，t=0.3907，P=0.7019)，其对细胞增殖抑制的影响最小。当采用5%、15%浓度的滋膵通脉饮含药血浆进行干预时，细胞增殖受抑制，各组OD值较正常组比较差异具有统计学意义(t=2.2605，P=0.0402，t=2.6247，P=0.0199)，故选用10%作为最佳含药血浆的干预浓度。见表1。

表1 不同浓度的滋膵通脉饮含药血浆对H9c2心肌细胞增殖的影响

2.2滋膵通脉饮含药血浆对H9c2心肌细胞自噬标志物LC3B Ⅱ/LC3BⅠ表达的影响:与正常组比较，模型组LC3B Ⅱ/LC3BⅠ表达明显降低；与模型组比较，滋膵通脉饮组与恩格列净组LC3B Ⅱ/LC3BⅠ的表达明显升高(P<0.05)；滋膵通脉饮组与恩格列净组LC3B Ⅱ/LC3BⅠ的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组H9c2心肌细胞自噬标志物LC3B Ⅱ/LC3BⅠ表达的比较

2.3滋膵通脉饮含药血浆对PI3K-Akt-mTOR 信号通路和凋亡蛋白的影响 与正常组比较，模型组PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表达明显升高；与模型组比较，滋膵通脉饮含药血浆组与恩格列净组PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表达明显降低(P<0.05)；滋膵通脉饮含药血浆组与恩格列净组PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 滋膵通脉饮含药血浆对PI3K-Akt-mTOR信号通路和凋亡蛋白的影响

3 讨 论

糖尿病属于以慢性高血糖为特点的代谢紊乱疾病之一，近年来其发病率激增。糖尿病心肌病是糖尿病常见的并发症，氧化应激、内质网应激、细胞外基质蛋白和晚期糖基化产物的堆积是糖尿病心肌病的早期特征。随着病情的进一步发展，逐步出现左心室肥厚和收缩功能不全，最后导致心衰的发生。糖尿病心肌病的病理特征表现为心肌细胞的变性坏死、细胞凋亡。自噬在维持心脏功能和结构，以及维护心肌细胞的完整性有不可估量的作用。适度的自噬对心脏的健康尤其重要。研究显示[5]，自噬紊乱与糖尿病心肌病的发生发展密切相关，恢复正常的自噬水平对糖尿病心肌病有明显的保护作用。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在多类细胞中广泛存在，经调理细胞能量代谢和周期等多种渠道施展非常重要的生理功能。PI3K是存在于体内的一种重要蛋白，许多生命活动的发生与发展都需要其介入。当细胞膜接受信号因子的指令后可激活PI3K，被激活的PI3K诱导质膜上的第二信使PIP3活化，Akt蛋白的Thr308位点可被PIP3磷酸化，进而激活Akt。Akt是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞的生长、增殖和存活。Akt从细胞浆转移到质膜，同时产生磷酸化，Akt活化后可通过激活下游蛋白-mTOR来调控胞内的凋亡及自噬。近年来PI3K-Akt-mTOR信号通路被认为是自噬调节中唯一的抑制性通路，在心肌细胞自噬调控中起着非常重要的作用[6]。激活PI3K/Akt/mTOR信号通路可抑制自噬的产生[7]。研究显示，芪苈强心胶囊可以通过调节AKT/mTOR通路，激活自噬，抑制细胞凋亡，减轻心肌损伤[8]。麦冬皂苷可以促进2型糖尿病大鼠心肌细胞自噬，使其心脏功能得到改善，其机制或许和抑制Akt/mTOR通路相关[9]。本研究显示，高糖刺激下的H9c2心肌细胞PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表达明显升高，而药物干预后恩格列净组和滋膵通脉饮含药血浆组PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表达明显下降，说明高糖刺激后H9c2心肌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活，从而抑制了自噬，出现了自噬障碍。而药物干预后PI3K/Akt/mTOR信号通路被抑制，自噬被激活，自噬小体也随之减少，减轻了心肌细胞损伤。

LC3蛋白作为一种自噬标志物，是自噬小体的标志蛋白，可分为 LC3-I和 LC3-Ⅱ 2种形式，一般用LC3-Ⅱ/ LC3-I的比值和p62的表达水平来评价细胞自噬。LC3-Ⅱ/ LC3-I 比值越高，说明自噬活性越强[10]。Caspase-3是细胞凋亡相关的关键蛋白[11]，当发生细胞凋亡时，促凋亡基因释放增多，导致细胞色素C进入细胞线粒体中，从而活化Caspase-3，被激活的Caspase-3可通过激活核因子、DNA裂解酶等一系列的途径破坏细胞内多种蛋白酶复合体，从而导致细胞凋亡的发生[12]。本研究显示，高糖刺激下的H9c2心肌细胞LC3B Ⅱ/LC3BⅠ明显下降，凋亡相关蛋Caspase-3表达明显升高，说明自噬障碍加重了心肌细胞损伤，加快了心肌细胞凋亡,而药物干预后恩格列净组和滋膵通脉饮含药血浆组LC3B Ⅱ/LC3BⅠ明显上升，凋亡相关蛋白Caspase-3表达明显下降,说明激活自噬可减轻心肌细胞凋亡。这也许同抑制PI3K/P-Akt/mTOR信号通路，激活心肌细胞的自噬相关。

本研究采用湖南省名中医卜献春教授的中药复方滋膵通脉饮对高糖诱导的心肌细胞进行干预，旨在模拟糖尿病心肌病的模型，结果显示，滋膵通脉饮可通过抑制PI3K/P-Akt/mTOR信号通路，激活心肌细胞自噬而减少心肌细胞凋亡蛋白的表达而抑制心肌细胞凋亡。滋膵饮出自于《医学衷中参西录》，原方由黄芪、生地、山药、生猪胰等组成，主要用于治疗消渴。卜献春教授之滋膵通脉饮系在原方基础上加减而成，方中丹参、川芎、生蒲黄、地龙、水蛭、鬼箭羽活血化瘀，辅以黄芪益气升阳，助主药活血通络；生地、麦冬、玄参、山茱萸、天花粉滋养五脏之阴，生津润燥，佐以僵蚕、全蝎熄风通络，山楂消食活血，同时防止滋阴活血药物碍胃。全方具有益气养阴、活血通络之效。本方加用了增液汤(生地、麦冬、玄参)，研究显示[13]，增液汤可以通过激活Akt1，调节PI3K-Akt信号通路，促进胰岛素的分泌、改善胰岛功能。研究显示[14]，黄芪的主要作用成分黄芪甲苷可以抑制糖尿病心肌病小鼠心肌氧化应激和炎症反应，减轻心肌细胞凋亡。地龙提取物在降低糖尿病心肌病大鼠血糖的同时，还能减轻心肌纤维化，改善心功能[15]。该研究从体外实验再次证明，滋膵通脉饮可激活心肌细胞自噬而抑制心肌细胞凋亡，这可能与抑制PI3K/P-Akt/mTOR信号通路有关。