LncRNA HCP5调节miR-27b-3p/H2AFZ轴对口腔鳞状细胞癌增殖侵袭迁移的机制研究

史晓晶， 周金阔， 张晋弘， 邸永宾

(河北医科大学第一医院， 河北 石家庄 050000)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是全球最常见的颌面部恶性肿瘤，具有易发生淋巴结转移、侵袭性较高等特点，每年的死亡病例超过14万，五年生存率小于50%，因此需要研发新的分子靶点及治疗标志物[1]。在肿瘤发生过程中，长链非编码RNA(LncRNA)作为一种竞争性RNA(ceRNA)与miRNA竞争性结合，从而相互调控影响下游mRNA的表达。生物信息学预测miR-27b-3p分别与LncRNA人类白细胞抗原复合物P5(HCP5)、蛋白家族成员Z(H2AFZ)存在结合位点，且研究表明LncRNA HCP5是一种新型LncRNA，可促进多种癌症的发展、转移和耐药性，但在OSCC中研究甚少[2]。miR-27b-3p是miR-27家族中成熟的miRNA。据报道miR-27b-3p在结直肠肿瘤、宫颈癌和胃癌等癌症中表达异常，使其成为肿瘤治疗的潜在靶点，但其在OSCC中鲜有报道[3]。H2AFZ表达异常与多种肿瘤发展密切相关。本研究旨在探讨LncRNA HCP5通过调节miR-27b-3p/H2AFZ轴对OSCC细胞增殖、侵袭、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1组织及细胞来源:选取于2021年2月至2022年2月在本院行手术治疗的48例OSCC患者，患者术前均未接受任何放疗或化疗等治疗并签署书面知情同意书，之后通过手术切除OSCC组织、相邻正常组织，并立即在液氮中冷冻，储存于-80℃冰箱中用于后续检测。本研究获得伦理委员会批准。中国科学院细胞库提供OSCC细胞系(Tca-811、SCC-9、SCC-25、HN4)及人正常口腔角质形成细胞(hNOK)。

1.2主要材料、仪器:MTT试剂、二甲基亚砜溶液(DMSO)(Sigma-Aldrich公司)；RIPA裂解缓冲液(碧云天生物科技有限公司)；PVDF膜(GE Healthcare公司)；ECL试剂盒(安玛西亚有限公司)；Trizol试剂盒(天根生化科技有限公司)；干扰HCP5(si HCP5)及阴性对照(si NC)、miR-27b-3p抑制物(miR-27b-3p inhibitor)及抑制物阴性对照(inhibitor NC)、miR-27b-3p模拟物(miR-27b-3p mimics)及抑制物阴性对照(mimics NC)(上海吉玛制药有限公司)；细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化型半胱天冬酶3(cleaved caspase-3)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、H2AFZ一抗(Abcam公司)。酶标仪(Bio-Rad公司)；倒置显微镜(上海精密仪器仪表公司)。

1.3qRT-PCR检测组织及细胞中LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表达水平:利用Trizol试剂盒从OSCC组织、相邻正常组织及OSCC细胞系(Tca-811、SCC-9、SCC-25、HN4)及人正常口腔角质形成细胞(hNOK)中提取总RNA；分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。通过GoScript逆转录试剂盒将总RNA逆转录反应得到cDNA，然后进行qPCR反应。PCR反应条件为95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。所用引物为：LncRNA HCP5上游引物：5′-TGAGAGCAGGACAGGAAAA-3′，下游引物：5′-CCAACCAGACCCTAAGTGA-3′；H2AFZ上游引物：5′-GTGGACTGTATCTCTGTGAA-3′，下游引物：5′-GGTTGGTTGGAAGGCTAA-3′；miR-27b-3p上游引物：5′-AGTGGCTAAGTTCTGCCTCAAC-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′；β-actin上游引物：5′-AGGGAGAACCGTGAGAAG-3′，下游引物：5′-CTGGTCCGACAGGTAGAA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。内参分别是U6、β-actin，2-ΔΔCt计算LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表达水平。

1.4细胞分组及处理:取对数生长期Tca-811细胞，分为对照组、si NC组、si HCP5组、si HCP5+inhibitor NC组、si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组。其中si NC组、si HCP5组分别将si NC、si HCP5转染Tca-811细胞；si HCP5+inhibitor NC组、si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组分别将si HCP5与inhibitor NC、si HCP5与miR-27b-3p inhibitor共转染Tca-811细胞，48h后收集各组细胞用于结果分析。

1.5MTT法检测细胞光密度(OD)值:将细胞接种在96孔板(3×103个细胞/孔)中并孵育0h、24h、48h。然后向每个孔中加入20μL MTT溶液，孵育4h后，弃去上清液。然后加入150μL DMSO，最后在酶标仪上于570nm处检测每个孔OD值。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡:将细胞接种到6孔板上(1×105个细胞/孔)，并用195μL缓冲液重新悬浮。然后在管中加入5μL Annexin V-FITC溶液并孵育15min。离心后将细胞重新在缓冲液中悬浮，并用10μL PI染色。最后用流式细胞术测定细胞凋亡。

1.7Transwell实验检测细胞迁移、侵袭:侵袭实验测定：将上室预先涂上Matrigel基质胶，然后各组Tca-811细胞(1×105细胞/孔)于无FBS的DMEM培养基中重悬并接种到上室，下室加入含有FBS的DMEM培养基。24h后轻轻刮除细胞，将0.4%结晶紫染色。最后随机选取五个视野在倒置显微镜下计数。迁移实验测定：上室无需预涂Matrigel基质胶，其余操作同上。

1.8qRT-PCR检测Tca-811细胞中LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表达水平同上述1.3的操作。

1.9验证miR-27b-3p与LncRNA HCP5、H2AFZ的靶向关系:首先构建HCP5、H2AFZ的野生型(WT)、突变体(MUT)载体。利用Lipofectamine 2000试剂盒将HCP5-WT、HCP5-MUT以及H2AFZ-WT、H2AFZ-MUT与miR-27b-3p mimics或mimics NC共转染到Tca-811细胞中。转染48h后，裂解细胞，检测相对荧光素酶活性。

1.10Western blot检测CyclinD1、cleaved caspase-3、MMP-2、H2AFZ蛋白表达水平:收集细胞并用RIPA裂解缓冲液裂解，取50μg蛋白质样品通过12% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜中，将膜在5%脱脂牛奶中封闭1h后，将膜与特异性一抗在4℃下孵育过夜。然后将膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育2h。洗涤后，使用ECL试剂盒对条带进行可视化，并使用β-actin作为对照，ImageJ软件分析蛋白表达水平，其中一抗分别为CyclinD1、cleaved caspase-3、MMP-2、H2AFZ。

2 结 果

2.1OSCC组织、相邻正常组织、OSCC细胞系及hNOK细胞中LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表达:OSCC组织中LncRNA HCP5、H2AFZ表达水平较正常组织升高，miR-27b-3p表达降低(P<0.05)，见表1。与hNOK细胞相比，OSCC细胞系LncRNA HCP5、H2AFZ表达水平升高，miR-27b-3p表达降低(P<0.05)，选择差异最显著的Tca-811细胞进行后续研究。见表2。

表1 LncRNA HCP5 miR-27b-3p H2AFZ mRNA表达水平

表2 细胞中LncRNA DLEU2 miR-27b-3p PAK4 mRNA的表达水平

2.2各组Tca-811细胞OD变化:细胞24h、48h OD570值比较：si HCP5组较对照组、si NC组降低(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组较si HCP5+inhibitor NC组升高(P<0.05)，见表3。

表3 细胞OD570值的比较

2.3各组Tca-811细胞中LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表达:LncRNA HCP5、H2AFZ表达水平比较：si HCP5组较对照组、si NC组降低(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组较si HCP5+inhibitor NC组升高(P<0.05)。miR-27b-3p表达比较：si HCP5组较对照组、si NC组升高(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组较si HCP5+inhibitor NC组降低(P<0.05)，见表4。

表4 Tca-811细胞中LncRNA HCP5 miR-27b-3p H2AFZ mRNA表达

2.4各组Tca-811细胞凋亡变化:细胞凋亡率的比较：si HCP5组较对照组、si NC组升高(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组较si HCP5+inhibitor NC组降低(P<0.05)，见图1、表5。

图1 细胞凋亡变化

表5 细胞凋亡变化的影响

2.5各组Tca-811细胞侵袭、迁移变化:细胞侵袭、迁移数的比较：si HCP5组较对照组、si NC组减少(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组较si HCP5+inhibitor NC组增多(P<0.05)，见图2、3、表6。

表6 细胞侵袭迁移数变化

图2 细胞侵袭变化

图3 细胞迁移变化

2.6验证miR-27b-3p与LncRNA HCP5、H2AFZ的靶向关系:Starbase数据库显示miR-27b-3p与LncRNA HCP5、H2AFZ存在碱基配对，如图4、5。荧光素酶活性比较，miR-27b-3p mimics+HCP5-WT组较mimics NC+HCP5-WT组降低(P<0.05)，见表7；miR-27b-3p mimics+H2AFZ-WT组较mimics NC+H2AFZ-WT组降低(P<0.05)，见表8。

图4 miR-27b-3p与HCP5的结合位点

表7 miR-27b-3p与HCP5的靶向关系验证

图5 miR-27b-3p与H2AFZ的结合位点

表8 miR-27b-3p与H2AFZ的靶向关系验证

2.7各组细胞中CyclinD1、cleaved caspase-3、MMP-2、H2AFZ蛋白表达水平:CyclinD1、MMP-2、H2AFZ蛋白表达比较：si HCP5组较对照组、si NC组降低(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组较si HCP5+inhibitor NC组升高(P<0.05)。cleaved caspase-3蛋白表达比较：si HCP5组较对照组、si NC组升高(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组较si HCP5+inhibitor NC组降低(P<0.05)，见图6、表9。

图6 CyclinD1、cleaved caspase-3、MMP-2、H2AFZ蛋白表达(Western blot图)注：A为对照组；B为si NC组；C为si HCP5组；D为si HCP5+inhibitor NC组；E为si HCP5+miR-27b-3p inhibitor组

表9 各组细胞中CyclinD1 cleaved caspase-3 MMP-2 H2AFZ蛋白表达

3 讨 论

OSCC由于其发病隐匿，加上病情进展迅速，患者被发现时多数无法进行有效治疗，随着OSCC机制研究和治疗方法等进步，近几十年来患者治愈率虽有所提高，但患者的五年生存率仍然没有显著改变[4]，因此研究无创性诊疗手段或分子靶标对OSCC的预防、早期诊断和治疗意义重大。

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的新型RNA，不参与编码蛋白质，但研究表明lncRNA在包括OSCC在内的多种人类癌症中具有影响细胞生物学行为、免疫反应和细胞转化等调节功能[5]。HCP5作为新发现的LncRNA，被证明与多种疾病有关，尤其是癌症中[6]。如HCP5的上调可以促进人膀胱癌中的细胞侵袭和迁移。但HCP5在OSCC进展中的作用和分子机制仍不清楚，需要进一步探索。本研究发现OSCC组织和细胞系中LncRNA HCP5表达上调，与Zhao等[7]研究结果相吻合，推测可能参与OSCC的发生。干扰HCP5表达可显著阻止Tca-811细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导其凋亡，提示LncRNA HCP5可能成为治疗OSCC的潜在靶点。

miRNA是另一种类型的非编码RNA，通过与靶基因的3'-非翻译区(UTR)结合，在转录后调节基因表达。研究报道miRNA和lncRNA可形成lncRNA-miRNA-mRNA轴，参与肿瘤的生长和发展。本研究经双荧光素酶实验验证LncRNA HCP5与miR-27b-3p存在靶向结合位点。在胃癌研究中，miR-27b-3p被证明为肿瘤抑制因子，上调miR-27b-3p阻碍了胃癌细胞的恶性行为发展[8]。另外，罗哌卡因可以增强miR-27b-3p的表达，而过表达miR-27b-3p可抑制乳腺癌的恶性进展[9]。本研究中miR-27b-3p在OSCC组织和细胞系中表达下调，与Ma等[10]研究结果吻合。干扰HCP5可通过上调miR-27b-3p表达改善Tca-811细胞的恶性肿瘤行为，通过miR-27b-3p inhibitor回复性实验发现上调miR-27b-3p逆转了干扰HCP5对Tca-811细胞恶性行为的抑制作用。除此之外，Starbase数据库及双荧光素酶实验验证H2AFZ为miR-27b-3p的直接靶标，且与多种肿瘤如膀胱癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等发展有关。本研究中H2AFZ在OSCC组织和细胞系中表达上调，与Feng等[11]研究结果一致。干扰HCP5可抑制H2AFZ表达改善癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导其凋亡，下调miR-27b-3p可提高H2AFZ表达，加速Tca-811细胞恶性发展，表明干扰HCP5可通过上调miR-27b-3p进而抑制H2AFZ表达，阻止Tca-811细胞恶性发展。

综上所述，干扰HCP5可以抑制Tca-811细胞增殖、迁移和侵袭，诱导其凋亡，可能与上调miR-27b-3p/H2AFZ轴有关，为OSCC治疗提供新靶点。