lncRNA MNX1-AS1在非小细胞肺癌中的表达及调控PI3K/AKT通路对癌细胞生物学行为的影响

刘桂霞， 邓科兰， 厉银平

(湖北省孝感市中心医院呼吸与危重症医学科, 湖北 孝感 432099)

肺癌是发病率与死亡率较高的肿瘤之一，非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要类型，约占所有肺癌的80%。目前，NSCLC治疗手段包括手术治疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等，多数患者确诊时已至晚期或发生转移，5年生存率较低。因此，研究NSCLC的发病机制，探索新的治疗靶点，对于改善预后具有重要意义[1]。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)在肿瘤发生、细胞生长和转录调控等多种生理活性中发挥重要作用，lncRNAs的异常表达与肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病密切相关[2]。lncRNA MNX1-AS1是位于第7号染色体上的lncRNA，据报道显示，lncRNA MNX1-AS1在卵巢癌、宫颈癌等多种肿瘤中表达水平升高，通过调节肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)等过程，促进肿瘤进展[3]。研究显示[4]，lncRNA MNX1-AS1在NSCLC组织中表达水平升高，与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移及预后相关，但lncRNA MNX1-AS1在NSCLC中的生物学功能尚不清楚。本研究分析lncRNA MNX1-AS1在NSCLC组织中的表达，探讨lncRNA MNX1-AS1在NSCLC细胞中的生物学功能及可能的作用机制，以期为NSCLC的诊治提供思路。

1 材料与方法

1.1材料:选取2017年6月至2019年3月期间在本院进行手术治疗的75例NSCLC患者的癌组织及癌旁正常组织，-80℃保存，该研究得到本院伦理委员会的批准。人支气管上皮细胞(BEAS-2B)及NSCLC细胞系(H1299、H2170、A549、PC-9)购于中国科学院细胞库；胎牛血清、RPMI 1640购自美国Invitrogen公司；携带干扰lncRNA MNX1-AS1表达质粒(si-MNX1-AS1)、其阴性对照质粒(si-NC)及引物购自上海吉玛制药技术有限公司；MTT试剂盒购自北京索莱宝公司；Omniscript RT Kit及miScript SYBR Green PCR Kit购自德国Qiagen；ECL试剂、TRIzol试剂、Lipo6000转染试剂(C0526)、兔抗人p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR)抗体购于碧云天生物技术有限公司。

1.2方 法

1.2.1细胞培养及分组:将BEAS-2B、H1299、H2170、A549、PC-9细胞接种于RPMI 1640培养基中(含有10%胎牛血清及双抗)进行传代培养，待细胞融合至70%左右时，胰酶消化收集细胞，用于后续实验。按照随机数字表法将PC-9细胞分为对照组(Control)、si-MNX1-AS1组、si-NC组，使用Lipo6000转染试剂对PC-9细胞进行转染，对照组不做转染处理，转染48h后qRT-PCR检测转染效率。

1.2.2RT-qPCR检测lncRNA MNX1-AS1:采用RT-qPCR检测NSCLC癌组织、癌旁正常组织及细胞中lncRNA MNX1-AS1表达，Trizol试剂提取总RNA，使用Omniscript RT Kit合成cDNA后，以GAPDH为内参，进行PCR扩增，lncRNA MNX1-AS1上游引物(5′-3′)：CACCAACGGGGAGTGGATAC，下游引物(5′-3′)：CTCCAGGGACCAACCAAGTC；GAPDH上游引物(5′-3′)：AGTCCACTGGCGTCTTCA，下游引物(5′-3′)：GAGTCCTTCCACGATACCAA，采用2-△△Ct法分别计算lncRNA MNX1-AS1表达量。

1.2.3MTT实验:转染后的各组PC-9细胞以2×103/孔接种于96孔板中，每组设置6个复孔，分别于24、48、72h时每孔加入5mg/mL的MTT液20μL，孵育4h后，加入150μL的DMSO溶液终止反应，检测吸光度值A490nm，绘制生长曲线。

1.2.4EdU实验:取对数生长期的各组PC-9细胞以4×104/孔接种于96孔板中，每孔加入100μL的EdU染色液(使用培养液稀释浓度为50μM)孵育2h，4%甲醛溶液室温固定30min，再加入0.5% TritonX-100透化10min，Hoechest复染细胞核，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5Transwell小室检测细胞迁移与侵袭:用无血清培养液PC-9细胞悬液，调整浓度为4×105个/mL，上室加入200μL细胞悬液，下室加600μL完全培养基，培养箱孵育24h，多聚甲醇固定，结晶紫染色，显微镜观察细胞迁移数。侵袭实验使用Matrigel基质胶包被Transwell上室，其余同迁移实验。

1.2.6Western blot实验:收集各组细胞，加入适量RIPA裂解，BCA法检测蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，室温封闭2h，分别加入p-PI3K(1∶1500稀释)、PI3K(1∶1000稀释)、p-AKT(1∶1000稀释)、AKT(1∶1500稀释)、p-mTOR(1∶1000稀释)、mTOR(1∶1000稀释)和GAPDH(1∶1000稀释)抗体，4℃过夜后，加二抗(1∶1000)孵育2h，ECL试剂显影，分析条带蛋白相对表达。

1.3统计学分析:每组实验设置6个复孔，实验数据符合正态分布用平均数±标准差表示，SPSS25.0、Graph Pad 8.0软件进行统计分析，两组间比较采取独立样本t检验，计量资料用n(%)表示，组间比较采用卡方检验，当P<0.05时，差异有统计学意义。

2 结 果

2.1lncRNA MNX1-AS1在NSCLC中表达:与癌旁组织比较，NSCLC组织中lncRNA MNX1-AS1表达水平显著升高(P<0.05)，见表1。

表1 lncRNA MNX1-AS1在NSCLC中表达

2.2lncRNA MNX1-AS1表达与NSCLC临床病理特征的关系:根据lncRNA MNX1-AS1在NSCLC组织中表达水平中位值，将NSCLC患者分为lncRNA MNX1-AS1高表达组(≥2.36)38例和lncRNA MNX1-AS1低表达组(<2.36)37例，分析发现lncRNA MNX1-AS1表达与TNM分期和淋巴转移有关(P<0.05)，见表2。

表2 lncRNA MNX1-AS1表达与NSCLC临床病理特征的关系n(%)

2.3lncRNA MNX1-AS1与NSCLC患者预后相关性:Kaplan-Meier生存分析显示，lncRNA MNX1-AS1高表达组患者3年累积生存率为42.11%(16/38)，显著低于低表达组的81.08%(30/37)，差异有统计学意义(χ2=11.132，P=0.001)，见图1。

图1 lncRNA MNX1-AS1表达水平与NSCLC患者预后关系

2.4lncRNA MNX1-AS1在NSCLC细胞系中表达:与BEAS-2B比较，lncRNA MNX1-AS1在H1299、H2170、A549、PC-9细胞中表达水平升高(P<0.05)，见表3，在PC-9细胞中表达水平最高，选择PC-9细胞进行后续实验。

表3 lncRNA MNX1-AS1 在NSCLC细胞系中表达

2.5lncRNA MNX1-AS1对PC-9增殖的影响:与Control组和si-NC组比较，si-MNX1-AS1组PC-9细胞增殖活性显著降低(P<0.05)，EdU染色结果显示，si-MNX1-AS1组EdU阳性细胞数较Control组和si-NC组减少，见图2、3，表明抑制lncRNA MNX1-AS1表达显著抑制PC-9细胞增殖。

图2 各组PC-9细胞生长曲线注：与Control组比较，#P<0.05；与si-NC比较，*P<0.05

图3 EdU实验检测细胞增殖(×40)

2.6lncRNA MNX1-AS1对PC-9细胞迁移与侵袭的影响:与Control组和si-NC组比较，si-MNX1-AS1组PC-9细胞迁移与侵袭数显著降低(P<0.05)，表明抑制lncRNA MNX1-AS1表达可显著抑制PC-9细胞迁移与侵袭。见图4、表4。

图4 各组PC-9细胞迁与移侵袭图片(×100)

表4 各组细胞迁移与侵袭数比较

2.7lncRNA MNX1-AS1对PC-9细胞PI3K/AKT通路蛋白表达的影响:与Control组和si-NC组比较，si-MNX1-AS1组PC-9细胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，表明抑制lncRNA MNX1-AS1表达可显著抑制PI3K/AKT通路的激活，见图5、表5。

图5 western blot检测各组PC-9细胞蛋白表达A：Control组；B：si-NC组；C：si-MNX1-AS1组

表5 各组细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达比较

3 讨 论

NSCLC是一种死亡率极高的恶性肿瘤，其早期诊断困难，晚期患者治愈率很低，恶性程度高且易转移与复发，患者生存率较低[5]。NSCLC的发生发展涉及多基因参与调控的过程，从基因水平研究NSCLC的发生发展机制越来越广泛，研究显示，多种lncRNA，如lncRNA ZEB2-AS1、LncRNA ANCR等在NSCLC中异常表达，与NSCLC发生发展密切相关[6]。

lncRNA MNX1-AS1基因位于7号染色体，可以转录产生992 bp的LncRNA，既往研究显示，lncRNA MNX1-AS1在结直肠癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、三阴乳腺癌等多种肿瘤中表达异常，与肿瘤的发生发展密切相关，可能是肿瘤潜在治疗靶点[7,8]。本研究结果显示，lncRNA MNX1-AS1在NSCLC癌组织与细胞系中表达水平升高，提示lncRNA MNX1-AS1表达与NSCLC发生有关，通过分析临床病理特征显示lncRNA MNX1-AS1表达与TNM分期和淋巴结转移有关，提示lncRNA MNX1-AS1与NSCLC的发生发展相关。Kaplan-Meier生存分析显示，lncRNA MNX1-AS1表达水平越高，患者预后较差，总生存率显著降低，与报道结果类似[9]。淋巴结转移是肿瘤的一种恶性行为，研究显示，lncRNA MNX1-AS1参与调节肿瘤的侵袭与转移，如Wang等[10]研究表明，lncRNA MNX1-AS1通过miR-218-5p调节RAB1A的表达，促进膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化，促进膀胱癌的生长和转移，体内实验表明，降低MNX1-AS1的表达可抑制肿瘤的生长和转移。Liu等[11]研究结果显示，lncRNA MNX1-AS1通过靶向抑制miR-527表达，上调BRAF表达促进肺癌细胞增殖、迁移与侵袭。本研结果显示，在PC-9细胞转染si-MNX1-AS1后，PC-9细胞增殖活性、迁移与侵袭能力显著下降，表明lncRNA MNX1-AS1参与NSCLC的发生与转移，与Liu等[11]人报道结果类似，提示lncRNA MNX1-AS1可能是治疗NSCLC的标志物。

PI3K/AKT通路在NSCLC的发生发展中发挥重要作用，AKT的活化可激活mTOR，使mTOR的磷酸化水平提高，从而介导细胞增殖、凋亡与能量代谢，PI3K/AKT/mTOR通路的激活与NSCLC细胞迁移、侵袭和耐药密切相关[12]。多项报道显示，lncRNA可通过影响PI3K/AKT/mTOR信号通路，影响NSCLC细胞的生长、转移和耐药，从而参与NSCLC的发生发展[13]。研究显示，在NSCLC中，敲低lncRNA ROR1-AS1表达可抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活，抑制NSCLC细胞的活力和侵袭能力，并抑制异种移植NSCLC肿瘤的生长[14]。在乳腺癌细胞中，lncRNA MNX1-AS1通过激活AKT/mTOR途径促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭及上皮间质转化[15]。本实验结果显示，PC-9细胞中抑制lncRNA MNX1-AS1表达后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著降低，表明lncRNA MNX1-AS1可通过影响PI3K/AKT/mTOR途径而调控NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭，参与NSCLC的发生发展。

综上所述，lncRNA MNX1-AS1在NSCLC中表达水平升高，通过激活PI3K/AKT通路影响NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭，促进NSCLC的发生发展，但其具体作用机制尚仍需结合动物模型做进一步研究。