半野生番茄GZ-01旱性砧木增强嫁接植株耐

2023-01-31韦建明张大龙李云洲

中国蔬菜 2023年1期

韦建明黄鑫米娜张大龙李云洲*

（1 贵州大学农学院，贵州贵阳 550025；2 山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018）

番茄（Solanum lycopersicum）是现代蔬菜的主导产业，也是乡村振兴的优势产业（聂大杭等，2022）。随着全球温室气体的不断排放，全球温度的不断升高，干旱已经成为威胁番茄安全生长的重要因素之一（Sunarti et al.，2022），因此提升栽培番茄抗旱能力对保障我国番茄安全生产具有重要意义。

干旱胁迫早期可以激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号途径（Li et al.，2017；Mo et al.，2021），MAPK 级联信号由三级组成：MAPKKK、MAPKK、MAPK，MAPK 处于整个级联信号系统下游位置，在番茄基因组中有16 个SlMAPKs（Kong et al.，2012），其中SlMAPK1、SlMAPK2、SlMAPK3以及SlMAPK6参与番茄抗旱防御反应（Li et al.，2013）。脱落酸（abscisic acid，ABA）在植物抗旱过程中发挥重要作用（Lucas et al.，2013），9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）和脱落酸8’-羟化酶（ABA 8’-hydroxylase，ABAH）是ABA 合成通路中的关键酶，而NCED1和CYP7070A1是番茄中ABA 合成与代谢的关键基因（Nitsch et al.，2009）。ABA 可以通过调控番茄叶片气孔关闭影响叶片蒸腾速率和植株抗旱性（Li et al.，2021）。另外，番茄在干旱胁迫后会激发细胞内氧化应激反应，累积超氧阴离子和过氧化氢（H2O2）（Das &Roychoudhury，2014；Hu et al.，2017；Podgórska et al.，2017）。抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等在保护细胞膜免受H2O2、破坏等方面发挥重要作用（Gill &Tuteja，2010；Miller et al.，2010；Das &Roychoudhury，2014；Hernández et al.，2016）。

嫁接是解决番茄抗旱的方法之一，该方法简单、高效、经济（Marsic et al.，2018），通过嫁接可以将两种不同性状的植株连接在一起，其中一种作为地下部分，称为砧木，另一种作为地上部分，称为接穗（潘可可等，2022）。嫁接可以将砧木中的抗性基因转移至接穗中，提高接穗的抗性（蒋梦婷等，2019）。Zhang 等（2019）报道，嫁接番茄可以缓解植株活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，提高植株光合能力和对干旱的耐受性。

本试验通过传统嫁接技术分析贵州半野生番茄GZ-01 砧木在提高嫁接植株耐旱性方面的作用，通过比较嫁接植株及果实生长生理表型与ABA、MAPK 级联信号系统相关基因的表达，挖掘GZ-01提高嫁接植株耐旱性机制，以期为贵州本土特色番茄砧木资源的开发利用提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红果番茄R（干旱敏感型）、粉果番茄P（耐旱型）和半野生番茄GZ-01 均来自贵州大学农学院植物病理教研室，其中GZ-01 被用作砧木，R和P 作为接穗。

1.2 试验设计

试验于2020 年6 月至2022 年6 月在贵州大学农学院进行。种子经过温汤浸种后在人工气候箱内进行催芽，催芽温度为（28±2）℃，3 d 后露白，播种于育苗钵（5.0 cm×5.0 cm×10.0 cm）并放置在人工气候箱内进行基质培养生长，生长温度为（25±2）℃，光/暗周期为16 h/8 h，待幼苗长至3～4片真叶时采用切接法进行嫁接。试验共设2个处理：嫁接植株RGZ-01（R 为接穗，GZ-01 为砧木）和PGX-01（P 为接穗，GZ-01 为砧木）。以R、P 和GZ-01 番茄植株作为实生苗对照，RR、PP 为自嫁接植株对照。嫁接后，用透明的塑料保鲜膜覆盖保水，便于嫁接苗伤口愈合，在弱光处放置24 h。每天8：00 和17：00 轻轻打开塑料保鲜膜以降低相对湿度，并在嫁接7 d 后转移至人工培养室进行培养，温度为（25±1）℃，光/暗周期为16 h/8 h，采用霍格兰氏营养液进行浇灌（Sanchez-Rodriguez et al.，2010），14 d 后转移至温室中进行胁迫处理。干旱胁迫采用20% PEG-6000 溶液浇灌植株根部，每天8：00 和17：00 各浇1 次，每次浇灌100 mL，连续浇灌7 d，每处理30 株。

1.3 嫁接植株及果实生长生理指标测定

干旱处理7 d 后，每处理随机选取3～5 株，测定植株从上往下数第3～5 片真叶鲜质量和根部鲜质量，然后将叶片和根通过烘箱进行干燥，测定叶片和根部干质量；使用便携式叶绿素测定仪（型号：CL-01）测定从上往下数第3～5 片真片的叶绿素含量；采用外渗电导法测定从上往下数第3～5片真叶的相对电解质渗漏率（REL）（李福德等，2019）；使用游标卡尺测量叶长、叶宽、节长、茎粗。

绿熟期、成熟期每处理随机选取10 个果实，使用游标卡尺测量果实横径、纵径。

1.4 叶片失水率测定和气孔形态观察

干旱处理7 d 后，每处理随机选取3～5 株，将从上往下数第3 片真叶取下并立即称重记作初始重量W0，之后分别在叶片离体0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 时测重记作Wt，计算叶片失水率。

干旱处理7 d 后，取从上往下数第3 片真叶，用镊子剥离背面表皮放置在载玻片上，加盖玻片后在高景深显微镜（型号：VHX-7000）下进行气孔开闭状态的观察与拍摄，并参照Xue 等（2021）的方法在叶片离体3.0 h 时统计气孔开放状态比例，每处理随机观察10 片叶片。

叶片失水率＝（W0-Wt）/W0×100%

1.5 防御酶活性测定

参照Shu 等（2021）的方法，分别取干旱处理1、3、5、7 d 时从上往下数第3～5 片真叶进行液氮速冻，用于苯丙氨酸解氨酶几丁质酶（CHI）、β-1，3-葡聚糖酶（GLU）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的提取及活性测定。每处理随机测定3～5 株。

1.6 抗氧化酶活性测定

参照Xu 等（2012）的方法，分别取干旱处理0、2、4 d 时从上往下数第3～5 片真叶，测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性。每处理随机测定3～5 株。

1.7 过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（）含量测定

干旱处理0、1、2、3、4、5、6、7 d，分别取植株从上往下数第3～5 片真叶，参照Xu 等（2012）的方法测定H2O2含量，使用超氧阴离子含量检测试剂盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕测定含量；干旱处理0、4 d 时叶片中H2O2和的积累量分别通过3，3’-二氨基联苯胺（DAB）和硝基蓝四唑（NBT）染色法进行染色、拍照，具体方法参考Li 等（2017）的方法。每处理随机测定3～5 株。

1.8 基因相对表达量测定

取干旱处理0、3 h 时植株生长点叶片0.5 g，液氮速冻备用。RNA 提取使用总RNA 提取试剂盒（南京诺维赞生物科技有限公司；型号：R401-01），反转录采用反转录试剂盒（HiScript1st Strand cDNA Synthesis Kit；型号：R211-01）。使用CFX96TMReal-time System 荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）进行qRT-PCR。以Actin作为内参基因，对不同处理番茄叶片的基因表达水平进行归一化处理。所有基因特异性引物序列如表1 所示。qRT-PCR 反应体系：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，40个循环；60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s。

表1 实时荧光定量PCR 分析所用引物序列

1.9 数据统计分析

利用Excel 2019 软件进行数据整理，使用GraphPad Prism 8 软件作图。采用SPSS v24.0 软件进行方差分析，运用Duncan’s 新复极差法比较各处理的差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下嫁接植株及果实生长生理指标测定

由图1 可知，干旱胁迫下，未嫁接（R、P、GZ-01）、嫁接（RGZ-01、PGZ-01）和自嫁接（RR、PP）番茄植株底部叶片均逐渐变黄，但RGZ-01 和PGZ-01 的株高明显高于其他植株。RGZ-01 的叶绿素含量、叶长、叶宽、茎粗、坐果率、叶干鲜质量、根干鲜质量均显著高于相应对照R，但其节长和相对电解质渗漏率显著低于R；PGZ-01 除叶长、叶宽与相应对照P 无显著差异外，其他指标测定结果与RGZ-01 一致，且节长和根鲜质量显著高于RGZ-01。RR、PP 的叶绿素含量和叶干质量分别显著高于相应对照R 和P，但叶长、叶宽、叶鲜质量、根干鲜质量和相对电解质渗漏率均与R、P 无显著差异。

以GZ-01 为砧木的嫁接番茄植株RGZ-01 和PGZ-01 的坐果率均显著高于未嫁接（R、P）和自嫁接植株（RR、PP）（图1），且PGZ-01 绿熟期和成熟期果实的横、纵径均高于其他植株（图2）。综上表明，GZ-01 砧木能够增强嫁接植株的耐旱性，且耐旱接穗P 与GZ-01 嫁接更加削弱了干旱诱导的生长抑制。

图1 干旱胁迫下GZ-01 砧木对嫁接植株生长生理指标的影响

图2 干旱胁迫下GZ-01 砧木对嫁接植株果实生长的影响

2.2 干旱胁迫下嫁接植株叶片失水率测定和气孔形态观察

不同干旱处理番茄植株离体叶片失水率及气孔形态变化如图3 所示，离体叶片均随时间变化持续失水，在干旱处理3.0 h 时，嫁接植株RGZ-01、PGZ-01 与自嫁接植株RR、PP 的水分散失率分别为12.57%、10.35%、16.59%和14.95%；且不同处理植株叶片气孔均呈现3 种状态，分别为关闭状态、半开闭状态和关闭状态。叶片离体3.0 h 时，未嫁接番茄植株的气孔开放状态比例为75.94%（R）、75.59%（P）和61.83%（GZ-01），嫁接植株气孔开放状态比例为15.29%（RGZ-01）和7.64%（PGZ-01），自嫁接植株气孔开放状态比例为19.89%（RR）和14.08%（PP）；RGZ-01、PGZ-01 的气孔关闭状态比例均高于其他植株，其中嫁接番茄PGZ-01的气孔关闭状态比例最大。以上结果均表明，以GZ-01 为砧木的嫁接番茄植株在干旱胁迫下抗性更强，且耐旱接穗P 与GZ-01 嫁接耐旱性更强。

图3 干旱胁迫下GZ-01 砧木对嫁接植株离体叶片失水率和气孔形态的影响

2.3 干旱胁迫下嫁接植株防御酶活性测定

由表2 可知，除干旱处理1 d 后的PPO 活性外，嫁接植株PGZ-01、RGZ-01 的CHI、GLU、PAL和PPO 活性均高于未嫁接植株R、P、GZ-01 和自嫁接植株RR、PP。其中，干旱处理3 d 时，RGZ-01 和PGZ-01 的CHI 活性最大；干旱处理5 d 时，RGZ-01 和PGZ-01 的GLU 和PPO 活性最大；干旱处理1 d 时，RGZ-01 和PGZ-01 的PAL 活性最大，且PGZ-01 的防御酶活性均高于RGZ-01。

表2 干旱胁迫下GZ-01 砧木对嫁接植株防御酶活性的影响

2.4 干旱胁迫下嫁接植株抗氧化酶活性和H2O2、含量测定

由图4 可知，干旱处理0 d 时，未嫁接、嫁接与自嫁接植株的抗氧化酶活性并无显著性差异，而干旱处理2、4 d 时，嫁接植株（RGZ-01、PGZ-01）抗氧化酶活性均显著高于未嫁接植株（R、P、GZ-01）和自嫁接植株（RR、PP），且PGZ-01 抗氧化酶活性均高于RGZ-01。其中，干旱胁迫2 d时，PGZ-01 的SOD、POD、CAT 和APX 活性分别比RGZ-01 高2.63%、7.67%、19.59%和6.27%。干旱胁迫4 d 时，PGZ-01 的SOD、POD、CAT 和APX活性分别比RGZ-01 高6.02%、10.24%、11.83%和15.62%；PP 抗氧化酶活性均显著高于其对应实生苗，RR 除CAT 外，其他抗氧化酶活性均显著高于其对应实生苗。

图4 干旱胁迫下GZ-01 砧木对嫁接植株抗氧化酶活性和H2O2、积累的影响

干旱处理后各处理番茄植株H2O2和含量迅速激增，并均在干旱处理4 d 时达到最大，而后随着干旱胁迫时间的延长，H2O2和含量呈下降趋势，直至7 d 时达到最低，且嫁接植株RGZ-01、PGZ-01 的H2O2和含量在7 d 的干旱处理过程中均低于自嫁接和未嫁接番茄植株；其中PGZ-01最低，RGZ-01 次之。通过DAB 与NBT 染色发现，在干旱处理0 d 时，未嫁接、自嫁接和嫁接番茄植株的H2O2、积累并无明显差异；干旱处理4 d 时，未嫁接和自嫁接番茄植株的叶片有大面积黄褐色与深蓝色斑块产生，并有不断向四周扩散的趋势，而嫁接植株PGZ-01 和RGZ-01 仅有少量浅黄色斑块和蓝色斑点产生。综上表明，GZ-01砧木能够通过嫁接调节接穗抗氧化酶活性和减少H2O2、的积累量，具有清除植株体内活性氧，从而减轻植株的ROS 损伤。

2.5 干旱胁迫下嫁接植株ABA 和MAPKs 防御相关基因的表达量测定

为探究GZ-01 砧木增强嫁接植株抗旱的分子机制，测定了不同嫁接处理番茄叶片ABA、MAPKs 信号通路相关基因的表达（图5）。与干旱胁迫0 h 相比，胁迫3 h 后不同嫁接处理番茄叶片中除SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK6外，SlNCED1、SlCYP301A1、SlMAPK3基因表达量均升高；此外，PGZ-01 和RGZ-01 叶片中其他防御相关基因的相对表达量显著高于其他植株，其中PGZ-01 防御相关基因的相对表达量均为最高。以上结果表明，在干旱胁迫诱导下，GZ-01 砧木能够通过嫁接调控MAPK 级联信号途径、ABA 信号途径参与干旱胁迫的抗性反应，在嫁接番茄植株抵御干旱胁迫中发挥重要作用。

图5 干旱胁迫下GZ-01 砧木对嫁接植株ABA 和MAPKs 防御相关基因表达的影响

3 讨论

本试验通过20% PEG-6000 溶液模拟干旱胁迫发现，MAPKs 防御相关基因在参与调控植株耐旱性中发挥重要作用，这个结果在Wang 等（2017）的研究中被证实，该研究通过CRISPR-Cas9 技术敲除番茄SlMAPK3，发现敲除株系对干旱更敏感。另外，张龙等（2021）通过过表达SlMAPK3发现可以提高番茄植株的田间抗旱性。除SlMAPK3外，过表达SlMAPK1同样可以提高番茄植株对干旱的抗性（Wang et al.，2018）。这与在拟南芥中报道的MAPK3/6 蛋白参与系统诱导抗性一致（Beckers et al.，2009；岳宁波等，2020）。此外，本试验还发现GZ-01 砧木能够影响接穗叶片气孔开闭比例，进而影响叶片蒸腾速率，从而直接影响植株耐旱性。Xue 等（2020）研究发现，MAPK 级联信号关键蛋白MAPK3/6 底物MAPK Substrates in the Stomatal Lineage（MASS）蛋白可以影响气孔发育。Lampard 等（2008）报道，MAPK 级联信号系统中MKK4/MKK5 或MPK3/MPK6 关键蛋白功能丧失会破坏气孔及叶片表皮细胞，导致气孔簇的形成。而本试验中，GZ-01 砧木嫁接植株中MAPK 级联信号关键基因SlMAPK1、SlMAPK2、SlMAPK3的表达量明显增加，但并未发现气孔簇的形成，推测GZ-01 砧木通过MAPK 级联信号系统调控气孔开闭，从而影响接穗的蒸腾量和耐旱性，但具体机制仍需进一步研究。

除MAPKs 外，Danquah 等（2014）报道ABA信号在调控干旱胁迫方面也发挥着重要作用。Liu 等（2016）发现ABA 可以通过调节气孔开闭影响植株抗旱性。本试验中，干旱胁迫下GZ-01砧木嫁接植株的ABA 合成相关基因SlNCED1和SlCYP701A1的表达量上调，促进了ABA 的累积，从而促使气孔关闭，减少水分蒸腾作用，增强植株的耐旱性。而MAPK 级联信号通路参与调控保卫细胞ABA 信号，从而影响植株的抗旱性（Liu et al.，2022）。因此，本试验中GZ-01 作为砧木嫁接可以提高嫁接植株的耐旱性，推断可能是通过调节MAPK 级联信号关键蛋白激酶SlMAPK3 的活性，影响ABA 信号途径，调节气孔开闭，从而提高植株的耐旱性。

Luna 等（2005）报道干旱胁迫可以诱导植物ROS 的累积，诱导脂质过氧化和造成细胞膜损伤，进而对整个植株造成损害。本试验条件下，RGZ-01与PGZ-01 番茄植株中H2O2和含量始终低于其他植株，而PGZ-01 的H2O2和含量又始终低于RGZ-01。表明GZ-01 砧木能够清除嫁接植株ROS，增强嫁接植株耐旱性，且耐旱性强弱与接穗植株有关。由于接穗R 和P 的耐旱性不同，推测相同砧木嫁接植株的耐旱性取决于接穗耐旱性；也可能是不同接穗和砧木的亲和性不同，导致同样砧木不同接穗的嫁接植株耐旱性存在差异。