一测多评法在丁香4 个成分检测中的应用研究
2023-01-31刘敏赵雯万林春
刘敏，赵雯，万林春
江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029
丁香为桃金娘科植物丁香Eugenia caryophllataThunb.的干燥花蕾，当花蕾由绿色转红时采摘，晒干［1］。丁香始载于《名医别录》［2］，别名“鸡舌香”“丁子香”“公丁香”［3］。丁香中含大量挥发油，为酚类、酯类、烯类等成分；具有良好的抗菌、抗氧化、麻醉止痛作用［4-5］。丁香是药食同源的药材，在临床、药品、食品、香精香料等方面多有研究与运用［6-8］。
目前，丁香质量控制项为丁香酚，采用外标法（ESM）进行含量测定。然而，丁香中有效成分较多，仅控制丁香酚一项指标难以反映丁香的整体质量。一测多评（QAMS）法通过测定内标物的含量，以内标物与其他待测物间的检测响应值的比例关系（相对校正因子），来计算其他待测物的含量［9-10］。因此，QAMS 能够解决对照品缺失和昂贵的问题，还能够提高方法的实用性，可以有效地、全面地控制中药的质量［11-12］。目前，一测多评法已成功应用于连翘、广藿香、苍术、砂仁等挥发性药材的质量评价中［13-16］。而有关于丁香的一测多评方法的构建未见报道。本课题拟建立丁香一测多评法，为丁香的质量控制方法进行补充，并为中药的品质评价方法研究提供参考。
1 仪器、试剂与试药
1.1 仪器
Agilent 6890N 气相色谱仪（美国安捷伦公司）；GC-2010 气相色谱仪（日本岛津公司）；Agilent DBWAX 毛细管柱（30 m ×0.32 mm，0.25 μm；美国安捷伦公司）；SH Rtx-WAX毛细管柱（30 m ×0.32 mm，0.25 μm；日本岛津公司）；BT25S 型电子天平、BSA124SCW 型电子天平［赛多利斯（北京）有限公司］。
1.2 试剂
均为分析纯试剂。
1.3 试药
丁香酚对照品（110725-201615，含量99.3%）购于中国食品药品检定研究院，β-石竹烯对照品（0001321406，含量98.5%）购于美国SIGMA 公司，α-石竹烯对照品（Z25M8H36799，含量93.0%）、乙酸丁香酚酯对照品（Z25M8H36798，含量98.0%）均购于上海源叶生物科技有限公司，其化学结构式见图1。本试验收集的21 批次丁香样品为国家药品评价性抽验（2017 年）样品，样品信息见表1。
图1 丁香四个成分化学结构式
表1 样品信息
2 方法与结果
2.1 方法学考察
2.1.1 色谱条件采用FID 检测器，DB-WAX 毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），载气为N2，流速25 mL/min，H2 流速30 mL/min，空气流速300 mL/min，柱温170 ℃；进样口温度280 ℃；检测器温度300 ℃，进样量1 µL，分流比10∶1。在上述色谱条件下，混合对照品和丁香样品色谱图见图2。
图2 色谱图：A.混合对照品；B.丁香样品
2.1.2 混合对照品溶液制备取丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯适量，精密称定，加正己烷溶解，配制成含丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯分别为2.125 0、0.402 6、0.046 1、0.434 7 mg/mL 的混合对照品溶液，置于8℃冰箱保存，备用。
2.1.3 供试品溶液制备取丁香样品，粉碎，过24目筛，取过筛的丁香粉末约0.3 g，精密称定，精密加入正己烷20 mL，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）15 min，放置至室温，再称定重量，用正己烷补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.4 线性关系考察精密吸取混合对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL 注入气相色谱仪，检测各色谱峰。以对照品进样质量（μg）为横坐标，色谱峰峰面积（X）为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯在测定范围内线性关系良好。保留时间、回归方程、相关系数、线性范围见表2。
表2 线性关系试验结果（n=3）
2.1.5 精密度试验精密称取同一丁香样品（批号：316040085），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6 次，测定四种化合物峰面积。结果测得丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯峰面积的RSD 分别为1.3%、1.3%、1.3%、1.3%。表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24h测定各时间点下4 种化合物色谱峰面积，计算4 种化合物色谱峰面积的RSD。结果丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯峰面积的RSD 分别为1.5%、1.4%、1.9%、1.7%。表明供试品中4 种化合物在24 h 内稳定性良好。
2.1.7 重复性试验精密称取同一丁香样品（批号：316040085）6 份，按“2.1.3”项下方法分别制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定。测得丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯平均含量分别为147.208 4 mg/g、12.408 1 mg/g、1.642 5 mg/g、23.464 7 mg/g，RSD 分别为2.0%、1.4%、1.7%、2.0%。结果表明试验方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率考察精密称取同一丁香样品（批号：316040085）6 份，每份0.15 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入每1 mL 含有丁香酚1.146 62 mg、β-石竹烯0.095 69 mg、α-石竹烯0.012 98 mg、乙酸丁香酚酯0.183 46 mg 的混合对照品正己烷溶液20 mL。按“2.1.3”项下方法制备回收率样品，按“2.1.1”项下色谱条件，测定4 种化合物色谱峰，分别计算丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的加样回收率以及RSD。结果见表3，表明方法回收率良好。
表3 丁香中四种活性成分的加样回收率（n=6）
2.2 相对校正因子计算
2.2.1 丁香待测指标相对校正因子计算依次精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL 分别进样，测定各成分色谱峰峰面积。以丁香酚为内参物，计算β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯相对于丁香酚的f 值，结果见表4。
表4 相对校正因子
2.2.2 一测多评法的耐用性和系统适应性评价精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液，采用DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、Rtx-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）两种色谱柱，分别在Agilent 7890N、岛津GC-2010 气相色谱仪上进样分析，记录4 种化合物色谱峰面积，计算以丁香酚为内参物的β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚的相对校正因子，结果见表5。结果表明β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚的相对校正因子重现性良好。
表5 不同仪器及色谱柱测得的相对校正因子
2.3 一测多评法待测色谱峰的定位
为准确定位待测色谱峰,试验分别用混合对照品溶液考察相对保留值和保留时间差在两根不同的毛细管柱及两台不同的气相色谱仪中的重现性。结果见表6，相对保留值的RSD 均小于2.0%，保留时间差的RSD 均小于8.0%；表明用相对保留值来定位色谱峰较为合理。
表6 不同仪器和色谱柱测得的相对保留值
2.4 一测多评法与外标法测定结果的比较
分别精密吸取21 批次按“2.1.3”项下制备的丁香供试品溶液1 μL，用“2.1.1”项下色谱条件测定4 种化合物的峰面积。采用外标法和“一测多评”法分别计算丁香中丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的含量，结果见表7。结果21 批丁香样品中4 种化学成分（丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯）的一测多评法计算值与外标法实测值之间相对误差不超过3.0%。表明一测多评法用于丁香的多成分质量评价研究是可行的。
表7 丁香中4种成分外标法和一测多评法含量测定比较（n=3） %
3 结论与讨论
丁香中含有多种挥发性成分，其中丁香酚的含量高、稳定性高，价格低廉易得，故选定丁香酚作为内标物。试验研究建立了以丁香酚为内标物，一测多评法同时测定丁香中β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的含量，结果表明，建立的方法便捷、高效、专属性强。采用一测多评法和外标法分别测定21 批丁香中四种挥发性成分的含量，结果显示两种方法测定结果的绝对误差不超过3.0%，表明一测多评法在缺少部分对照品的情况下，能够实现对丁香药材的多指标成分含量测定，并对丁香的质量进行更加全面的评价，为全面提升丁香药材的质量提供了新方法。
