不同纳米过滤系统过滤静注人免疫球蛋白的效果评价

马力，李冠军，张学成，范蓓，马小伟，王志刚

华兰生物工程股份有限公司研发中心，河南 新乡 453003

血液制品是以健康人混合血浆为原料，经不同的分离纯化工艺制备的生物制品。血液制品的生物安全一直是监管部门、生产企业和社会关注的重点。静注人免疫球蛋白（intravenous human immunoglobulin，IVIG）作为血液制品的主要成员，在临床应用广泛。

目前，IVIG 采用的病毒灭活／去除方法通常有低pH 孵放灭活、巴氏灭活、辛酸灭活、S／D 灭活和纳米除病毒过滤等方法［1⁃5］。不同的病毒灭活／去除方法其作用原理不同，低pH 孵放依靠pH 值、温度以及孵放时间可有效实现对脂包膜病毒灭活；巴氏灭活需加入大量的蛋白保护剂在高温条件下实现对脂包膜病毒的灭活，高温条件灭活病毒的同时不可避免地会对蛋白造成破坏，使蛋白变性；辛酸灭活和S／D 灭活通过加入灭活剂破坏病毒脂包膜实现病毒灭活，灭活剂的加入会造成最终产品的灭活剂残留；纳米除病毒过滤依据过滤孔径实现病毒的截留，可有效去除脂包膜和非脂包病毒，且易于保持蛋白质的天然活性。纳米除病毒过滤作为一种新型的病毒去除方法已广泛应用于血液制品行业［6⁃9］。

纳米除病毒过滤器的材质主要有聚醚砜、再生纤维素和聚偏氟乙烯。纳米除病毒过滤方式分为切向流过滤和死端过滤两种方式。过滤器材质、过滤方式以及预过滤系统均会影响蛋白过滤效果［10⁃11］。本研究旨在探讨不同预过滤器及其纳米过滤器组成的纳米过滤系统对IVIG 过滤效果的影响，以筛选最佳纳米过滤系统。

1 材料与方法

1.1 IVIG 为本公司采用层析工艺制备。

1.2 主要仪器 纳米过滤器A 和预过滤器Y1 购自德国默克密理博公司；纳米过滤器B 和C 购自日本旭化成株式会社；纳米过滤器D、E 和预过滤器Y2、Y3、Y4 购自德国赛多利斯公司；预过滤器Y5 购自美国3M公司。

1.3 纳米过滤器的筛选 取IVIG 原液，分别采用不同的纳米过滤器（工作方式见表1），按照相应的产品说明书过滤压力进行除病毒过滤，记录过滤时间和过滤体积，并按下式计算衰减速率和过滤蛋白量，以过滤速度衰减至10%为过滤终点，筛选最佳纳米过滤器。

表1 不同纳米过滤器工作方式Tab.1 Working modes of various nanofilters

衰减速率（%）=相邻时间点过滤速度／过滤初始速度；

过滤蛋白量（kg／m2）=过滤体积×蛋白质浓度

1.4 预过滤器的筛选 取IVIG 原液，选择1.3 项筛选的纳米过滤器，分别采用不同预过滤器（工作方式见表2）串联纳米过滤器，按照相应说明书进行除病毒过滤，记录过滤时间和过滤体积，并计算衰减速率和过滤蛋白量，筛选最佳纳米过滤组合系统。

表2 不同预过滤器的工作方式Tab.2 Working modes of various prefilters

1.5 结果分析 分别以过滤蛋白量和过滤衰减速率为纵坐标，过滤时间为横坐标绘制趋势图，评价纳米过滤效果。试验均进行3 次，结果采用3 次数据平均值。

2 结果

2.1 纳米过滤器的筛选 不同纳米过滤器过滤效果差异明显。过滤蛋白量：纳米过滤器C > E > A >D > B，见图1；过滤衰减速率：C < E < B < D < A，见图2。纳米过滤器A 和D 单位时间内过滤通量相对于其他过滤器较高，但过滤衰减速率也最快；纳米过滤器C、B 和E 过滤衰减速率优于其他过滤器，且纳米过滤器C 过滤蛋白量最高。表明切向流过滤模式的过滤衰减速率均优于死端过滤模式；纳米过滤器B 由于过滤压力低于其他纳米过滤器，其过滤蛋白量较低。依据不同纳米过滤器过滤特点和成本，选择C为最佳纳米过滤器。

图1 不同纳米过滤器的过滤蛋白量Fig.1 Filtered protein load of various nanofilters

图2 不同纳米过滤器的衰减速率Fig.2 Attenuation rate of various nanofilters

2.2 预过滤器的筛选 过滤蛋白量：预过滤器Y1 >Y5>Y2>Y3>Y4，见图3；过滤衰减速率：预过滤器Y1

图3 不同预过滤器的过滤蛋白量Fig.3 Filtered protein load of various prefilters

图4 不同预过滤器的衰减速率Fig.4 Attenuation rate of various prefilters

3 讨论

纳米膜除病毒过滤已广泛应用于血液制品中。不同的纳米过滤器因其过滤器材质、过滤方式不同，过滤效果有所差异。本研究中切向流过滤方式的过滤衰减速率优于死端过滤方式，但死端过滤方式的过滤初始通量优于切向流过滤。这与纳米过滤器结构特点相关，纳米过滤器A、D，其过滤孔径采用的是喇叭口设计（即过滤孔径由大至小），可有效提高过滤初始通量。切向流纳米过滤器B、C、E采用的中空纤维管壁开口设计，过滤孔径相对均一，因此其过滤初始通量相对较低，但过滤衰减相对较慢。

采用不同的预过滤器过滤后，对后续纳米过滤均产生了正影响。但不同预过滤器因过滤器材质、过滤方式不同，对纳米过滤效果的影响程度有所差异。本研究中深层过滤过滤器对纳米过滤效果提高均优于绝对过滤过滤器。预过滤器Y1、Y2 和Y5 具备电荷吸附和深层过滤两种机制，电荷吸附可能会对过滤料液进一步纯化，提高过滤效果；预过滤器Y3 为具备电荷吸附的绝对过滤，电荷吸附可能会对过滤料液进一步纯化，因此过滤效果优于预过滤器Y4。

不同纳米过滤器的材质不同，其亲水性和疏水性有差异。不同料液其目标蛋白、缓冲液、稳定剂差异可能会对不同纳米过滤器表现出不同的相容性，进而影响过滤效果［12］。不同材质纳米过滤膜的最适pH 有一定差异性，有文献表明，不同pH 值可能会对纳米过滤的物理结构产生一定影响［13］。不同纳米过滤膜对料液最适蛋白质含量适用性不同，如纳米过滤器A 依据厂家指导意见过滤蛋白浓度以不高于15 mg／mL 为宜。不同的纳米过滤器适宜的蛋白质含量应依据试验而定。为了保证蛋白稳定性和活性，通常需加入相应的稳定剂，不同的稳定剂作用机理不同，也可能会影响纳米过滤效果。有文献表明，料液中稳定剂会使病毒聚集，减缓过滤衰减速滤，提高过滤效果［14］。

不同纳米过滤器因其材质、制备工艺和市场因素差异，其成本有所差异。对于生产企业而言，生产成本控制也是考虑的重要因素。因此需结合不同纳米过滤系统的过滤效率、产品特点和生产成本控制选择最佳的纳米过滤系统。如纳米过滤器A 的过滤衰减速率快，但单位时间过滤通量大，较适合如单抗类蛋白稳定性较差，不易长时间过滤的产品；纳米过滤器C 单位时间过滤通量较低，但过滤衰减速率较慢，较适于如血液制品等蛋白稳定性好的产品。

综上所述，本研究探讨了不同预过滤器及不同纳米过滤膜组成的纳米过滤系统的过滤效果，为不同蛋白制剂选用纳米过滤系统提供了理论支持。