肿瘤疫苗在结肠癌模型小鼠体内抑制效果的评价

韩卢，梁朝远，石思伟，杨立群，邓雄威，盛望

1.北京工业大学环境与生命学部，北京 100124；2.国家纳米科学中心，北京 100190

有报道显示，2018年全球恶性肿瘤新发病率约1 808 万例，死亡病例约956 万例，中国分别占约23.7%和30%［1］。美国癌症统计数据及中国肿瘤流行统计数据均表明，结肠直肠癌导致死亡的病例数列第三位［2⁃3］。目前，手术是治疗结肠直肠癌的首选途径，但存在术后复发的可能，虽然放化疗可在一定程度上可防止肿瘤复发，但部分患者存在不适合及副反应大的情况［4⁃5］，预后效果仍不理想。因此，亟需寻找预防和治疗结肠直肠癌的新方法。

有研究表明，肿瘤疫苗可激活患者的免疫系统，使其识别肿瘤相关抗原（tumor⁃associated antigens，TAAs），从而破坏肿瘤细胞，防止肿瘤复发［6］。目前，多数肿瘤疫苗均是将TAAs和免疫辅助剂组合，免疫机体后激活树突状细胞（dendritic cells，DCs），产生信号，诱导CD8+T 细胞成熟，分化为TAAs 特异性细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）。肿瘤疫苗主要通过主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）途径发挥作用，DCs识别肿瘤细胞抗原后，经其表面MHC提呈，使T细胞活化、增殖，活化的T 细胞从血管中迁移至肿瘤部位，浸润肿瘤，进行特异性杀伤肿瘤细胞。多数TAAs 均在肿瘤细胞膜表面，裂解肿瘤细胞可获得含有多种特征和非特征的抗原，用其制备的肿瘤疫苗可针对患者体内多种TAAs［7］。这种肿瘤疫苗的制备过程简单、成本低，但其免疫原性较弱，抗原提呈细胞对其摄取效率较低。生物纳米颗粒可作为疫苗的佐剂及抗原的包装载体，增强细胞对肿瘤裂解物的吸收，促进激活抗原提呈细胞，包括壳聚糖纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、纳米脂质体、聚多巴胺纳米颗粒等［8⁃11］。CpG1826 为一段寡核苷酸，是具有较强的抗肿瘤作用一种DNA 佐剂［12］。本课题组前期研究组装了纳米递送系统，构建β 葡聚糖⁃CpG 复合佐剂纳米颗粒，且具有良好的佐剂刺激效果［13⁃14］，也可用于包装新抗原［15］，表明纳米化的CpG 可作为载体和佐剂用于疫苗的制备。本研究采用纳米化的CpG 与结肠癌肿瘤细胞裂解液分别于体外刺激小鼠骨髓来源树突状细胞（bone marrow⁃derived dendritic cells，BMDCs）成熟后，按一定比例混合，制备肿瘤裂解物纳米疫苗，免疫小鼠后，检测小鼠体内细胞因子的分泌水平，评价该疫苗在动物体内的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 细胞 C57BL／6小鼠结肠癌细胞系MC38细胞购自北京协和细胞库，由北京工业大学环生学部保存。

1.2 主要试剂及仪器 CpG1826由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；CpG β⁃葡聚糖纳米颗粒（CpG β⁃glucan nanoparticles，CNP）由北京工业大学环境与生命学部按文献［14］方法制备；粒细胞⁃巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte⁃macrophage colony⁃stimulating factor，GM⁃CSF）及白细胞介素⁃4（interleukin⁃4，IL⁃4）均购自美国 Peprotech 公司；IL⁃6、IL⁃12p40、肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）和干扰素γ（interferon γ，IFNγ）ELISA 检测试剂盒、anti⁃CD11c⁃FITC、anti⁃MHC⁃Ⅱ⁃PE、anti⁃CD80⁃APC、anti⁃CD86⁃Percpcy5.5、anti⁃CD3⁃FITC、anti⁃CD8⁃PE 及 TruStain FcXTMPLUS（anti⁃mouse16／32）抗体封闭液均购自美国 BioLegend 公司 ；RPMI1640 培养基、FBS 及 PBS（pH 7.4）均购自美国Gibco 公司；红细胞裂解液、PBS⁃EDTA、ELISA 终止液及小鼠淋巴分离液均购自北京达科为生物技术有限公司；70 μm 筛网及FACS流式细胞仪（FACS Calibur型）购自美国BD公司。

1.3 实验动物 SPF 级C57BL／6J小鼠，雌性，30只，6～8周龄，体质量18～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物合格证号为：SCXK（京）2019⁃0010，饲养于北京神瑞生物技术有限公司动物房。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行（文件号为：PONY⁃BG356⁃2018A）。

1.4 小鼠BMDCs 的分离 将2 只小鼠脱颈处死，浸泡于75%酒精中，进行表面消毒处理；随后无菌取小鼠的胫骨和股骨，置75%酒精中浸泡5 min；剔除骨头上残留肌肉，PBS 洗涤干净；用RPMI1640 培养液冲洗骨髓，收集培养液，经70 μm 筛网过滤，转移至10 cm 培养皿，室温静置30 min；收集未贴壁细胞，800 ×g离心 5 min，弃上清，用 RPMI1640 培养基重悬，计数。将获得的BMDCs 按4 × 106个／孔加至6孔板，再加入RPMI1640培养基（含10%FBS、1%PBS、20 ng／mL GM⁃CSF和10 ng／mL IL⁃4），4 mL／孔，于37 ℃，5%CO2培养箱培养3 d，更换新培养基；培养5 d时，半量更换新培养基；培养7 d，收集悬浮细胞，800×g离心5 min，弃上清，加入1 mL培养基重悬，计数。

1.5 BMDCs 的体外刺激试验 将BMDCs 细胞液浓度调整为1×106个／mL，加入24孔板，1 mL／孔，于37 ℃培养24 h。将BMDCs分为PBS组（2 μL／孔）、NP组（无CpG 纳米颗粒，2 μg／孔）、Lysate 组（MC38 细胞裂解物，2 μg／孔）、CpG 组（CpG1826，2 μg／孔）、CNP组（CNP，2 μg／孔），每组均设3个复孔，于37 ℃培养 24 h；收集细胞，用anti⁃CD11c⁃FITC、anti⁃MHC⁃Ⅱ⁃PE、anti⁃CD80⁃APC、anti⁃CD86⁃Percpcy5.5 混合液（等体积比混合）染色30 min，上流式细胞仪检测；收集培养上清，采用相应ELISA 试剂盒测定IL⁃6 及IL⁃12p40的含量。

1.6 肿瘤裂解物纳米疫苗的制备 用含10% FBS 和1%PS 的 RPMI1640 培养基，于 37 ℃，5%CO2培养箱中培养MC38 细胞，待长满单层后，用PBS 洗涤1 次，0.25%胰酶消化，800×g离心5 min；弃上清，用1 mL PBS 重悬，计数，调整密度为1× 107个／mL，置液氮冷冻5 min；迅速转移至37 ℃水浴5 min，反复冻融5次，4 ℃，2 000 ×g离心10 min；取上清，即肿瘤裂解物，BCA法检测蛋白浓度，于-20 ℃保存。将200 mg／mL CNP 和 50 mg／mL 肿瘤裂解物按 1∶1 的体积比混合，制备成肿瘤裂解物纳米疫苗。

1.7 动物分组及给药 将小鼠适应性饲养约5 d，随机分为4组：PBS组、CNP组、Lysate组、Vaccine 组，分别经小鼠皮下注射PBS（100 μL／只）、CNP［20 μg／（100μL·只）］、MC38细胞裂解物［50μg／（100μL·只）］、肿瘤裂解物纳米疫苗（100 μL／只），每组5 只。每周免疫1 次，连续给药3 次，末次免疫后1 h，经小鼠右下肢皮下接种MC38 细胞，2×105个／只，于接种后3、6、9 d 测量并记录各组小鼠体内肿瘤的最大直径和最小直径，并按下式计算肿瘤体积。以时间为横坐标，肿瘤体积为纵坐标，绘制肿瘤生长曲线。

肿瘤体积（cm3）=1／2×最大直径（cm）×最小直径（cm）2

1.8 各组小鼠血液中 IFNγ 和 TNF⁃α 含量的检测最后一次测量肿瘤体积后，用10%水合氯醛麻醉小鼠，经眼眶采血，置EDTA抗凝管，800×g离心10 min，取上层血浆，采用相应ELISA 试剂盒测定其IFNγ 和TNF⁃α 含量；下层血浆于-80 ℃保存，用于后续试验。

1.9 各组小鼠血液中CD3+CD4+T 及CD3+CD8+T细胞比例的检测 取下层血液，加入1 mL PBS，用滴管将稀释血液沿试管壁缓慢加至含有2 mL 淋巴细胞分离液的离心管中，于4 ℃，1 500×g离心20 min；取中间白膜层，即外周血单核细胞，用PBS洗涤1次，加入 TruStain FcXTMPLUS（anti⁃mouse16／32）抗体封闭液，室温封闭5 min；分别加入anti⁃CD80⁃APC、anti⁃CD3⁃FITC、anti⁃CD8⁃PE，室温避光孵育 20 min；PBS洗涤1 次，制成单细胞悬液，经流式细胞仪检测，应用FlowJo 10.0软件分析检测结果。

1.10 小鼠脾细胞中 IFNγ 和 TNF⁃α 含量的检测1.8项小鼠采血后，经脱颈处死，无菌取小鼠脾脏，置RPMI1640 培养基中，于 70 μm 筛网中研磨，用 PBS冲洗筛网，收集细胞，800 ×g离心5 min；弃上清，加入5 mL红细胞裂解液，于冰上裂解5 min；加入10 mL PBS⁃EDTA 终止反应，于室温，800 ×g离心 5 min；弃上清，用 2 mL 含 10% FBS 和 1% PS 的 RPMI1640培养基重悬，计数。将小鼠脾细胞加至96 孔板，1×106个／孔，加入MC38肿瘤裂解物，40 μg／孔，37 ℃刺激72 h；收集上清，用相应ELISA 试剂盒检测IFNγ和TNF⁃α含量。

1.11 统计学分析 应用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，GraphPad Prism 6.0 软件绘制图表，试验数据均以均值 ± 标准差（）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMDCs 的体外刺激试验 CNP 组 BMDCs 表面标志物CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+MHC⁃Ⅱ+的表达水平明显高于CpG、PBS、NP 及Lysate 组（t=4.3 ~ 20.5，P均 < 0.05），见表 1。表明 CNP 可促进BMDCs 成熟。CNP 组 BMDCs 的培养上清中 IL⁃6 和IL12p40 含量明显高于CpG、PBS、NP 及Lysate 组（t=5.8 ~ 46.2，P均 < 0.01），见表 2。表明 CNP 可显著提高BMDCs分泌IL⁃6和IL12p40的水平。

表1 各组BMDCs表面标志分子的表达情况（%，，n=3）Tab.1 Expression of marker molecules on cell surface of BM⁃DCs in various groups（%，，n=3）

表1 各组BMDCs表面标志分子的表达情况（%，，n=3）Tab.1 Expression of marker molecules on cell surface of BM⁃DCs in various groups（%，，n=3）

注：与 CNP 组比较，a 表示 P < 0.05；aa 表示 P < 0.01；aaa 表示P<0.001。

组别CNP CpG PBS NP Lysate CD11c+CD80+30.0±1.5 22.0±2.0aa 12.0±0.2aaa 12.0±0.6aaa 14.7±0.1aaa CD11c+CD86+27.0±1.6 19.7±1.4aa 12.5±1.1aaa 13.3±2.7aa 12.7±2.7aaa CD11c+MHC⁃Ⅱ+24.7±1.3 19.4±1.7a 13.8±1.3aaa 12.9±0.4aaa 13.6±1.1aaa

表2 BMDCs培养上清中IL⁃6和IL12p40的含量（pg／mL，，n=3）Tab.2 Contents of IL⁃6 and IL⁃12p40 in the supernatant of BM⁃DCs（pg／mL，，n=3）

表2 BMDCs培养上清中IL⁃6和IL12p40的含量（pg／mL，，n=3）Tab.2 Contents of IL⁃6 and IL⁃12p40 in the supernatant of BM⁃DCs（pg／mL，，n=3）

注：与CNP组比较，aa表示P<0.01；aaa表示P<0.001。

IL⁃6 8 398.8±313.5 3 380.6±1 115.1aa 31.2±6.1aaa 34.6±3.2aaa 33.4±7.1aaa IL12p40 10 867.3±1 072.2 5 028.4±1 386.8aa 19.3±1.3aaa 23.0±2.9aaa 19.9±4.7aaa组别CNP CpG PBS NP Lysate

2.2 小鼠体内肿瘤的生长曲线 Vaccine组小鼠体内的肿瘤体积明显小于PBS、CNP、Lysate 组（t分别为3.4、2.7、2.6，P均 < 0.05）；Lysate 组小鼠体内的肿瘤体积虽略小于PBS 组和CNP 组，但差异均无统计学意义（t分别为1.9和1.3，P均 <0.05）。见图1。

2.3 小鼠血液中IFNγ 和 TNF⁃α 的含量 Vaccine 组小鼠血液中的IFNγ 含量明显高于PBS、CNP、Lysate组（t分别为4.6、4.6、3.8，P均 < 0.05），TNF⁃α 含量与其他3 组差异无统计学意义（t分别为2.0、1.1、0.4，P均 >0.05）。见表3。

表3 各组小鼠血清中IFNγ 和TNF⁃α 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.3 Contents of IFN γ and TNF⁃α in serum of mice in various groups（pg／mL，，n=5）

表3 各组小鼠血清中IFNγ 和TNF⁃α 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.3 Contents of IFN γ and TNF⁃α in serum of mice in various groups（pg／mL，，n=5）

注：a表示与Vaccine组比较，P<0.05。

IFNγ 169.5±77.3 10.7±0.3a 11.2±0.8a 30.7±28.0a TNF⁃α 12.9±0.3 13.4±0.5 12.3±1.2 12.3±0.4组别Vaccine PBS CNP Lysate

2.4 小鼠血液中的 CD3+CD4+T 及 CD3+CD8+T 细胞比例 Vaccine 组小鼠血液中CD3+CD8+T 细胞比例与PBS、CNP、Lysate 组比较，差异无统计学意义（t分别为0.5、0.6、0.7，P均 > 0.05）；Vaccine 组小鼠血液中CD3+CD4+T 细胞比例略高于其他组，但差异也无统计学意义（t分别为 0.7、0.9、1.9，P均 >0.05）。见表4。

表4 各组小鼠血液中的CD3+CD4+ T 及CD3+CD8+ T 细胞比例（%，，n=5）Tab.4 Proportion of CD3+ CD4+ T and CD3+CD8+ T cells in blood of mice in various groups（%，，n=5）

表4 各组小鼠血液中的CD3+CD4+ T 及CD3+CD8+ T 细胞比例（%，，n=5）Tab.4 Proportion of CD3+ CD4+ T and CD3+CD8+ T cells in blood of mice in various groups（%，，n=5）

组别Vaccine PBS CNP Lysate CD3+CD8+T 13.6±1.9 12.6±2.1 14.1±0.6 13.2±1.2 CD3+CD4+T 13.3±3.5 12.1±1.2 11.6±2.2 10.1±1.1

2.5 小鼠脾脏中 IFNγ 和TNF⁃α 的含量 Vaccine 组小鼠脾脏中 IFNγ 和 TNF⁃α 含量均明显高于 PBS、CNP、Lysate 组（t分别为 6.3 ~ 13.0，P均 < 0.001），见表5。

表5 各组小鼠脾脏中IFNγ 和TNF⁃α 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.5 Contents of IFN γ and TNF⁃α in spleen of mice in various groups（pg／mL，，n=5）

表5 各组小鼠脾脏中IFNγ 和TNF⁃α 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.5 Contents of IFN γ and TNF⁃α in spleen of mice in various groups（pg／mL，，n=5）

注：aaa表示与Vaccine组比较，P<0.001。

组别Vaccine PBS CNP Lysate IFNγ 2 807.5±952.3 79.0±36.3aaa 76.1±20.5aaa 375.7±154.7aaa TNF⁃α 70.3±7.4 23.8±6.2aaa 21.8±4.0aaa 38.6±8.6aaa

3 讨 论

目前，疫苗接种是癌症免疫预防的最佳途径，如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和人类乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗。疫苗接种具有安全性高、可产生长期记忆、成本低、供给方便等优势，不仅可单独使用，还可联合其他方法使用［16］。肿瘤裂解物疫苗具有制备方法简单，生产成本低的优点，疫苗中含有大量免疫原性表位，可通过体液免疫与细胞免疫途径发挥作用，达到预防或治疗的作用。肿瘤裂解物与佐剂的联合使用，尤其是纳米化的佐剂，可增强体内的免疫效果。CpG 寡核苷酸是通过 Toll 样受体 9（Toll⁃like receptor 9，TLR9）发挥免疫激活作用［17⁃18］，与其他TLR不同，TLR9存在于细胞内，CpG 寡核苷酸通过细胞内吞作用进入细胞后与TLR9 结合。肿瘤裂解物进入体内，被DCs 吞噬，经抗原递呈给T 细胞促进其分化为特异性CTL。佐剂CpG可增强该过程，从而促进免疫应答效果。DCs作为功能最强的抗原提呈细胞，在先天免疫和适应性免疫关系中起重要作用。未成熟的DCs表现出强大的捕获抗原能力，但不能有效地处理抗原和刺激T 细胞。摄取抗原后，未成熟的DCs 分化为成熟的DCs，同时表型和功能也发生变化。成熟的DCs 表达高水平的表面标志物（如MHC⁃Ⅱ、CD80和CD86等），促进抗原呈递并分泌细胞因子［19］。在相同的剂量下，纳米化 CpG 可比非纳米化 CpG 激活更强的免疫应答［20］。临床前和临床研究中，由于CpG 寡核苷酸能够启动肿瘤微环境中的免疫激活，打破免疫抑制和治疗耐受，可用于治疗各种癌症，因此受到广泛关注［21］。

本研究用CNP 体外刺激BMDCs 成熟，结果显示，相同剂量CNP比CpG表现出了更好的刺激效果，明显促进了细胞因子IL⁃6和IL⁃12p40的表达（P均 <0.01），增强了细胞免疫和体液免疫效果。小鼠皮下接种疫苗后，MC38 肿瘤生长缓慢，肿瘤体积明显小于其他组（P均< 0.05），表现出良好的免疫预防效果；CD3+CD8+T及CD3+CD8+T细胞比例差异均无统计学意义（P均 >0.05）；血液中IFNγ 含量明显升高（P均 < 0.05），TNF⁃α 含量差异无统计学意义（P均 > 0.05）；脾脏中IFNγ 及TNF⁃α 含量均明显升高（P均<0.001），显示出了良好的抗肿瘤效果。

综上所述，构建的CNP 能够有效激活并促进DCs 成熟，增强 IL⁃6 和 IL⁃12p40 等细胞因子的分泌，提高体液和细胞免疫水平；与肿瘤裂解物联合制备成的疫苗，在结肠癌小鼠模型中具有良好的预防效果，也促进了体内的抗肿瘤细胞因子的释放，为肿瘤预防和治疗提供了新的思路和策略。另外，本研究中各组小鼠数量较少，难免影响检测结果，因此，后续研究中将增加各组小鼠数量，以期获得更准确的结果。