内源性大麻素系统调控对心肺复苏后肾脏TXB、PGE2和PGD2含量的影响

周小红，李宁康，黑云鹏，包树臻，宫德瀛，高 慧，海克蓉

心搏骤停(CA)是指心脏射血功能突然终止、大动脉搏动与心音消失、重要器官严重缺血缺氧，从而导致生命终止的临床综合征。心肺复苏(CPR)是心搏骤停的首选治疗方法，但组织缺血一段时间，当血流重新恢复后细胞代谢障碍与结构破坏反较缺血时进一步加剧，器官功能进一步恶化而造成多器官组织缺血-再灌注损伤(IRI)，可以引起全身炎症反应和血液高凝[1]。肾脏由于其组织功能及结构的特殊性，是对IRI敏感的器官之一，因此在心肺复苏后容易发生肾功能障碍。临床工作中 12% ～ 13% 的心跳骤停可出现肾脏功能衰竭，其死亡率高达 50%，故研究CPR后的肾脏衰竭防治具有重要临床意义[2]。单酰甘油脂肪酶(MAGL)是内源性大麻素(ECS)水解酶，特异水解2-花生四烯酸甘油(2-AG)[3]，同时2-AG在MAGL作用下很快代谢为花生四烯酸(AA)，AA在COX2作用下代谢为血栓素B2(TXB2)、前列腺素E2(PGE2)和前列腺素D2(PGD2)等。本文采用 Laurance Kates[4]大鼠CA模型，研究内源性大麻素水解酶抑制URB602对花生四烯酸代谢产物和内源性大麻素含量的影响，为CPR后的肾脏保护治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料:清洁级雄性SD大鼠26只由四川达硕生物科技有限公司提供，合格证号为SCXK(川)2013-30。随机分为3组，Sham组6只，CPR组、CPR+URB602组各10只。Sham组不建立心肺复苏模型，只做气管插管和股动静脉穿刺术；CPR组与 CPR+URB602组建立心肺复苏模型，CPR+URB602组复苏后1 min给予URB602。实验前 12 h禁食不禁水，戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉完善后建立心肺复苏模型。实验通过四川大学动物伦理委员会审核(Protocol # 2016042)。

1.2 动物建模：根据Laurence Katz等[5]报道大鼠CA-CPR模型鉴定标准,评价CA-CPR模型[5]的成功(心电图显示心电静止、室颤、心电机械分离；心尖区心脏搏动消失；动物口唇黏膜明显发绀；MAP ≤10 mmHg)，见图1(目录后)。窒息8 min后开放夹闭的气管导管，立即心肺复苏及吸入100%氧气进行机械通气，用中指和食指在剑突上一横指处，按压深度为胸廓前后径三分之一，按压频率200 次/min左右，所有动物按压由一人完成。自主循环恢复ROSC定义为心电图出现正常的QRS波群(夹闭气管前的心电图表现)；可触摸到明显的心脏搏动，皮肤黏膜发绀改善；平均动脉压大于60 mmHg以上，维持10 min时视为自主循环恢复。如行CRP 5 min以上而未有ROSC，则视为CPR失败，放弃复苏。

1.3 检测指标和组织制备:①自主循环恢复后6 h取肾脏组织，液氮冷冻后快速放入-80℃冰箱冻存，批量检测2-AG以及TXB2、PGE2和PGD2含量；②自主循环恢复后6 h 开胸心脏取血1 mL,在低温下3 000 r/min离心，血清分装后批量检测尿素氮(BUN)gng 肌酐(Cr)含量。

1.4 检测方法[6]

1.4.1 花生四烯酸代谢产物和ECS含量检测:①标准曲线制备。100 μL 0.1%甲酸水溶液中分别加入10 μL工作溶液、10 μL混合内标(d4-AEA50 ng/mL,PEA-d4 200 ng/mL,2-AG-d5 34 μg/mL,AA-d8 15 μg/mL)，混匀后加入200 μL乙酸乙酯-正己烷(9∶1)萃取，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，收集上层有机相液；下层再加入200 μL乙酸乙酯-正己烷(9∶1)萃取，离心，合并有机相，在氮气下吹干，残余物用100 μL乙腈复溶，20 000 r/min离心15 min后进样测定。②称取组织50 mg，冰浴下剪碎，依次加入100 μL冰上预冷的0.1%甲酸水溶液、磁珠2～3颗，10 μL混合内标、200 μL 乙酸乙酯-正己烷(9∶1)，用磁珠匀浆仪匀浆30 s，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，收集上层有机相液；下层再加入200 μL乙酸乙酯-正己烷(9∶1)萃取，离心，合并有机相，在氮气下吹干，残余物用100 μL 乙腈复溶，20 000 r/min离心15 min后进样测定。③用Agilent 1260-6460高效液相色谱质谱联用仪检测。

1.4.2 肾脏功能检测：取出冻存的血清室温下复融，取400 μL全自动生化分析仪检测BUN和Cr含量 (mindray BS-120,China)。

2 结果

2.1 大鼠自主循环恢复情况：20只大鼠自主循环恢复18只，其中CPR组和CPR+URB602组各9只自主循环恢复，CPR组有6只存活6 h，CPR+URB602组有8只存活6 h。

2.2 复苏后各组大鼠基础数值比较:各组大鼠在体重、MAP、HR复苏前差异无统计学意义(P>0.05)。所有死亡动物尸体解剖后未发现明显异常，见表1。

表1 3组大鼠基础数值比较

2.3 2组大鼠自主循环恢复时间：CPR组合和CPR+URB602组大鼠自主循环恢复时间分别为(70±15)s和(69±17)s，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组大鼠复苏后肾脏功能改变：CPR组和CPR+URB602组大鼠在ROSC后6 h BUN和Cr含量和Sham组比较差异无统计学意义(P>0.05),但CPR组BUN和Cr含量较CPR+URB602组有所上升(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肾脏功能比较

2.5 复苏后各组大鼠肾脏2-AG、AEA、AA、TXB2、PGE2和PGD2含量比较:与Sham组相比，CPR+URB602组和CPR组在ROSC后6 h的2-AG 、AEA、AA、TXB2、PGE2、PGD2 均升高，CPR组AA、TXB2、PGE2、PGD2 较CPR+URB602组升高更明显(P<0.05)，但CPR+URB602组2-AG升高更明显(P<0.05)，见图1(目录后)。

3 讨论

本试验结果提示复苏后6 h,内源性大麻素干预组存活大鼠多于常规复苏组，并且复苏后大鼠出现内源性大麻素水平增高，AA及其代谢产物含量增高。给予URB602后AA及其代谢产物含量降低。2个复苏组BUN和Cr数值较Sham组有升高，且未给URB602组的大鼠升高的更明显，提示内源性大麻素可能通过降低AA及其代谢产物含量而保护肾脏功能，进而使得复苏后6 h 存活大鼠数量增多。在临床试验中发现，CA后复苏成功患者复苏早期即存在肾功能改变，多在1～3 d内表现最为明显[8]。动物实验证明,CA-CPR后肾功能损害持续时间长，在复苏后120 h可能再次出现肾功能损害[9]。本研究虽然存活6 h的大鼠并没有发现肾脏功能的明显损伤，但其可能原因是检测的两项指标还不够敏感，不能反映早期肾脏的损伤，也可能是因为由于肾脏有较强的代偿功能，肾脏损伤所表现出的时间一般比心脏损伤出现的晚一些[7]。

心肺复苏过程实质上是全身缺血-再灌注的过程，可引发各种炎性介质释放及凝血障碍(血液高凝),血液高凝进一步导致组织微循环障碍和内皮损伤[1]。肾脏由于其组织功能及结构的特殊性，是对缺血-再灌注敏感的器官之一。肾缺血-再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭的重要损伤环节。肾脏为高灌注器官，对缺血及缺血后再灌注均较敏感，造成缺血-再灌注损伤的相关因素很多，涉及众多机制。而肾脏炎性介质释放和凝血障碍症反应介质释放是肾脏损伤的重要机制。缺血-再灌注时激活中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、淋巴细胞等炎症细胞，参与肾缺血-再灌注损伤[10]。再灌注损伤后炎症反应发生的一个早期先决条件是局部化学趋化因子的表达。肾脏对缺血非常敏感，肾缺血时首先影响血管内皮细胞，内皮细胞受损后，进而导致组织局部产生的一些炎性因子及炎症介质增加，包括细胞因子TNF-α、IL-1、补体活化产物、血小板激活因子、花生四烯酸的代谢产物以及活性氧代谢物等，它们可使黏附分子表达增强。炎性因子、炎性介质及黏附分子作用于肾脏，可诱导肾小管上皮细胞凋亡[11]。在本实验中可以发现实验组应用内源性大麻素水解酶抑制剂URB602后，AA及其代谢产物降低，而说明它有抗炎作用。在AA的降解产物中，TXA2是血小板内具有重要生理功能的信息分子。血小板膜磷脂上AA经环氧酶、血栓素合成酶代谢产生TXA2，它能反馈性地直接激活PLC，降低血小板内cAMP水平并且诱导血小板聚集[12]。而URB602可以降低TXB2(TXA2不稳定，很快代谢为TXB2)水平，改善血液高凝状态，可能会改善微循环，进而保护肾脏，提高存活率。

单酰甘油脂肪酶[13]是ECS水解酶，特异水解2-AG为AA，AA又代谢为前列腺素和TXA2，TXA2不稳定很快转化为TXB2。2-AG能够与大麻素受体1和大麻素受体2结合，产生类似大麻素的作用。本研究发现给予URB602后肾脏阻滞2-AG明显升高，而AEA2组变化不明显，说明URB602主要是MAGL水解酶抑制剂，通过减少2-AG降解而发挥作用。

总之，给予内源性大麻素水解酶抑制剂后可以降低肾脏TXB2、PGE2和PGD2含量，对心肺复苏肾脏保护有益处。