犬瘟热、犬细小病毒胶体金二联检测卡研制

余春明，郑雪莹，范君文，史 记，李华斌，郑金来，邓柏林

（1.北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629；2.北京标驰泽惠生物科技有限公司，北京 102629）

犬瘟热是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）引起的急性、热性、高度接触性传染病[1]，在春冬季节多发，导致病犬的肺、脾、肝等多种脏器产生病变。CDV 可通过排泄物、气溶胶等传播，病犬是其主要传染源[2]。CDV 宿主种类繁多，除犬类外，猫类、熊类甚至海洋哺乳动物也可被感染[3]。此外在人类骨组织中也曾检出CDV基因，提示其可能对人类健康有潜在危害[4]。犬细小病毒病由犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）引起，临床症状主要为出血性肠炎和心肌炎[5-8]，患病犬只表现为食欲不振、精神萎靡。CPV 的传染源主要是病犬及其排泄物，康复的犬只也可长时间带毒。这两种病的发病率和死亡率均较高，发病后如不及时治疗，犬瘟热死亡率可达80%以上[9]，犬细小病毒病也可达50%[10-11]。

犬瘟热和犬细小病毒病在发病早期临床症状相似，且往往呈混合感染，单凭临床症状难以作出鉴别诊断，确诊必须借助实验室手段[12]。目前国内检测CDV、CPV 的现行标准主要基于病毒分离鉴定和免疫学试验，但这些方法均存在耗时较长、操作繁琐等缺点[13]。免疫胶体金快速诊断技术是一种将金标记、免疫检测和液相层析等技术合为一体的固相标记免疫检测技术，具有简便快速、特异性强、灵敏度高、肉眼可判读、结果易保存、无需特殊仪器等优点，已在医学、动植物检疫、食品安全监督等领域得到了广泛应用[14]。为了实现CDV和CPV 的同步快速检测，本研究开发了CDV、CPV 胶体金二联检测卡，用于两种疾病的临床快速诊断和大规模检测工作，以期为提高犬源重要传染病的监测和控制水平提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与实验动物 CDV、CPV，均由北京标驰泽惠生物科技有限公司提供；SPF 级Balb/c 小鼠（8～12 周龄，雌性），购自军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂与仪器 弗氏完全佐剂、PEG 4000、HAT（H0262）、BSA，购自Sigma 公司；HRP-山羊抗小鼠IgG，购自北京博尔西科技有限公司；Protein A 亲和层析柱，购自GE 公司；抗体类及亚类胶体金检测试纸条，购自北京五康新兴生物技术有限公司；2 种CDV 抗原快速检测卡，分别购自赛诺利康生物技术有限公司（A）、深圳芬德生物技术有限公司（B）；2 种CPV 抗原快速检测卡，分别购自北京荣科利康科技有限公司（英国STANDARD 检测卡，C）、义乌市宠爱有佳宠物用品有限公司（美国艾博检测卡，D）；CDV 荧光定量PCR 检测试剂盒，购自中联瑞生物科技有限公司；CPV 荧光定量PCR 检测试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；XYZ 三维划膜喷金仪，购自上海金标生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫小鼠 分别以CDV 和CPV 为免疫原，将200 µg 病毒与200 µL 弗氏完全佐剂混合后充分乳化，每只Balb/c 小鼠多点皮下注射200 µL；2 周后加强免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，免疫量不变；间隔2 周后进行第二次加强免疫，免疫量不变；在细胞融合前3 d，腹腔注射含200 µg 病毒抗原的生理盐水，以进一步增强免疫效果。

1.2.2 杂交瘤细胞株制备和筛选 用常规方法收集免疫小鼠的脾细胞，将脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞按10:1 体积比在500 g/L PEG 4 000 的诱导下进行融合；将融合的细胞用HAT 培养液在5%CO2、37 ℃培养箱中选择培养10～15 d；取上清用间接ELISA 法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。间接ELISA 的操作步骤：用110 µL 质量浓度为1 µg/mL 的病毒抗原包被板，拍干后，以1%BSA 封闭液封闭，以1:2 000 稀释的免疫小鼠血清为阳性对照，以无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清为阴性对照，每孔加入100 µL 1:2 000 稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG。测定各孔OD450nm，以OD450nm大于阴性对照孔OD450nm的2 倍为阳性判断依据。

1.2.3 杂交瘤细胞株鉴定 进行多次亚克隆和间接ELISA 筛选，以细胞培养液为阴性对照。P/N＞2.1 判为阳性，否则判为阴性。将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株按照克隆位置进行编号。

1.2.4 抗体效价测定 采用间接ELISA 法检测杂交瘤细胞株培养上清的抗体效价。以空白细胞培养液为阴性对照，以免疫小鼠血清为阳性对照。测定各孔OD450nm，以OD450nm大于阴性对照孔OD450nm的2 倍为阳性判断依据。

1.2.5 杂交瘤细胞株传代培养 将杂交瘤细胞株在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液（含有100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）中连续培养、传代。培养到第10 代后，通过间接ELISA 法检测培养液的抗体效价，并在倒置显微镜下观察细胞是否能够连续传代，判断细胞株是否为可持续增殖、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

1.2.6 杂交瘤细胞保存 去掉细胞培养瓶中旧的培养液，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，使细胞悬浮；1 000 r/min 离心10 min，去上清，细胞沉淀用细胞冻存液（二甲基亚砜:胎牛血清:RPMI-1640 体积比为1:2:7）复溶制成悬液，密度为5.0×105个细胞/mL；台盼兰染色，计数活细胞（占比95%以上合格）；将细胞无菌分装至细胞冻存管，1.0 mL/管；4 ℃放置2 h 后-20 ℃放置2 h，之后液氮罐气态部分（-70 ℃）放置2 h，最后转入液氮中长期保存。

1.2.7 单克隆抗体制备及纯化 选择成年Balb/c 小鼠，每只小鼠腹腔接种0.5 mL 液体石蜡；7～10 d 后每只小鼠腹腔接种1×106～5×106个第16 代杂交瘤细胞；7 d 后，小鼠腹部明显膨大，待行动不便时断颈采集腹水；腹水经10 000 r/min 离心30 min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清用15～30 倍体积的10 mmol/L PBS 稀释，用Protein A 亲和层析柱进行亲和纯化，上柱液为pH 7.0～7.6的10 mmol/L 的PBS 缓冲液，洗脱液为pH 3.5 的100 mmol/L 柠檬酸缓冲液，洗脱下来的抗体尽快用1 mol/L pH 9.6 的Tris-HCl 调整pH 至中性，得到单克隆抗体。

1.2.8 单克隆抗体鉴定

1.2.8.1 纯度鉴定 对获得的单克隆抗体进行8%SDS-PAGE 电泳纯度鉴定。取20 µL 抗体与15 µL SDS 上样缓冲液混合点样，80 V 电泳30 min。

1.2.8.2 类及亚类鉴定 采用抗体类及亚类胶体金试纸条检测单克隆抗体亚型。

1.2.9 胶体金二联检测卡研制

1.2.9.1 硝酸纤维素膜包被 根据预试验结果，以1C5（标记）-4B5（包被）、1C6（标记）-4B8（包被）的配对模式研制胶体金试纸条（图1）。用质量浓度为2 mg/mL 的单克隆抗体4B5 包被检测T1 线，质量浓度为3 mg/mL 的单克隆抗体4B8包被检测T2 线，质量浓度为3 mg/mL 的HRP-山羊抗小鼠IgG 包被质控C 线。具体操作步骤：用XYZ 三维划膜喷金仪分别将上述抗体喷于300 mm长、20 mm 宽的硝酸纤维素膜上；质控C 线和检测T1 线与检测T1 线和T2 线间距均为0.3 cm；将包被好的硝酸纤维素膜置于干燥室中（相对湿度≤30%）干燥6 h 备用。

图1 胶体金检测卡结构

1.2.9.2 单克隆抗体标记胶体金 在磁力加热搅拌作用下，向三角瓶中加入145 mL 纯化水，煮沸；加入5 mL 1%四氯化金溶液，煮沸；加入7 mL 1%柠檬酸三钠溶液，煮沸5 min，得到胶体金溶液，冷却后保存于2～8 ℃。取1 mL 胶体金溶液于离心管中，加入10 µL 0.2 mol/L 的碳酸钾溶液，室温静置5 min；加入10 µL 单克隆抗体1C5，混匀后静置30 min；加入10 µL 20% BSA 溶液，平衡5 min；加入10 µL 20% PEG 20000 溶液，平衡30 min；10 000 r/min 离心10 min，去上清液；加入100 µL 金标复溶液（含有2%蔗糖、1%酪蛋白、0.5% BSA、0.1% Triton X 100、0.1% SDS 的硼酸缓冲液）后备用。用同样方法标记抗体1C6。

1.2.9.3 结合物释放垫制备 将胶体金标记的单克隆抗体1C5 和1C6 等体积混合，按照8 µL/cm的速度喷膜，置于干燥室中（相对湿度≤30%）干燥6 h 备用。

1.2.9.4 胶体金试纸条和检测卡组装 在PVC 背板上粘贴硝酸纤维素膜，在靠近硝酸纤维素膜质控C 线的一端粘贴吸水垫，在靠近检测T2 线的一端粘贴结合物释放垫和样品垫，按所需大小进行切割，得到CDV、CPV 检测胶体金试纸条，放入干燥剂后密封保存。将制备的胶体金试纸条装入塑料卡中，制成检测卡。

1.2.10 胶体金二联检测卡特性测试

1.2.10.1 特异性测试 利用制备的胶体金检测卡分别检测CDV、CPV、犬冠状病毒（CCV）、犬传染性肝炎病毒（ICHV）和犬副流感病毒（CPIV），观察有无检测条带出现。

1.2.10.2 灵敏度测试 将CDV、CPV 的重组质粒分别稀释至拷贝数浓度依次为1.3×105～1.3×100拷贝/µL，并用荧光定量PCR 方法进行同步检测，检验胶体金检测卡的灵敏度。

1.2.10.3 准确性测试 分别在东城、西城、朝阳、顺义、大兴、怀柔6 个区/县，各选取5 个动物诊疗机构作为CDV、CPV 胶体金二联检测卡应用示范点。每季度采样1 次，每次采样20 份，1 年为1个周期，共采样4 次，采样量约2 000 份。以荧光定量PCR 检测结果作为参考，使用本研究制备的二联检测卡与目前应用较多的4 种单一检测卡进行同步检测，评价其临床应用效果。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞鉴定

经过2 次细胞融合，4 次亚克隆和间接ELISA筛选，获得多株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。根据克隆产生位置编号，分别命名为1C5（CDV）、4B5（CDV）、1C6（CPV）、4B8（CPV）和5F8（CPV），其中5F8杂交瘤细胞株抗体信号较弱。

2.2 抗体效价测定

经测定，1C5、4B5、1C6、4B8 杂交瘤细胞株培养上清的效价均≥1:320，5F8 杂交瘤细胞效价接近1:80，效价较低。结合初步筛选时5B8 抗体信号较弱，故将其放弃，选择1C5、4B5、1C6和4B8 杂交瘤细胞株进行后续试验。

2.3 杂交瘤细胞传代培养

经验证，4 株杂交瘤细胞传至10 代以上仍然生长良好、能够稳定分泌单克隆抗体，培养液上清效价均≥1:320。

2.4 抗体纯度鉴定

SDS-PAGE 电泳结果（图2）显示，4 株单克隆抗体均出现两条带，无明显杂带。说明抗体纯度良好，可以满足试验需求。

图2 4 株单克隆抗体纯度鉴定结果

2.5 抗体类及亚类鉴定

经检测，4 株单克隆抗体均为IgG 亚型。

2.6 胶体金二联检测卡特异性测试

利用制备的胶体金检测卡分别检测CDV、CPV、CCV、ICHV 和CPIV。结果（图3）显示，仅CDV 和CPV 出现检测线，其他病毒均未出现检测线。

图3 胶体金二联检测卡特异性测试结果

2.7 胶体金检测卡灵敏度测试

结果（图4）显示，荧光定量PCR 和胶体金检测卡检测CDV 阳性DNA 模板的最低检测限分别为1.3×101和1.3×102拷贝/µL；检测CPV阳性DNA 模板的最低检测限分别为1.3×101和1.3×102拷贝/µL。

图4 荧光定量PCR 及胶体金二联检测卡灵敏度测试结果

2.8 准确度测试

本研究制备的胶体金二联检测卡、市场上常用的A、B 抗原快速检测卡与CDV 荧光定量PCR结果的符合率分别为88.0%、86.0% 和90.0%（表1）；二联检测卡与A、B 检测卡的符合率分别为97.7%和97.8%（表2）。

表1 3 种CDV 检测卡结果与荧光定量PCR 结果的符合率统计

表2 3 种CDV 检测卡结果的符合率统计

本研究制备的胶体金二联检测卡、市场上常用的C、D 抗原快速检测卡与CPV 荧光定量PCR的符合率分别为90.8%、92.5%和88.3%（表3）；二联检测卡与C、D 检测卡的符合率分别为98.2%和97.2%（表4）。

表3 3 种CPV 检测卡结果与荧光定量PCR 结果的符合率统计

表4 3 种CPV 检测卡结果的符合率统计

3 讨论

随着人们生活水平的提高，犬只的饲养量也在飞速增长。截至2018 年，北京市注册犬数达到100 万只以上。据调查数据推算，我国养犬数量超过1.3 亿只。宠物犬作为主要伴侣动物，其健康关系到亿万家庭的和谐。犬瘟热和犬细小病毒病是犬中常发的两大传染病，早期的临床症状相似且常为混合感染。在宠物犬中，贵宾犬、松狮犬是犬细小病毒病易感品种，吉娃娃、金毛犬是犬瘟热易感品种，哈士奇对二者都易感[15]。目前犬瘟热和犬细小病毒病主要以免疫预防为主，并配合早发现、早治疗，但现行常用的实验室检测方法步骤繁琐，耗时较长，检测成本也较高，市面上常见的胶体金试纸条也大都针对单一病毒。

本研究通过细胞融合获得了4 株可稳定分泌CDV 和CPV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并以此为基础制备了胶体金二联检测卡，实现了CDV和CPV 的同步快速检测。该检测卡特异性强，只与CDV 和CPV 产生检测条带，而不与CCV、ICHV、CPIV 等犬类病毒反应；灵敏度高，其灵敏度仅比荧光定量PCR 方法低10 倍，最低检测限可达102拷贝/µL；准确性好，与荧光定量PCR 方法的符合率高于88.0%，与市面上常用的单一病毒检测卡符合率高于97.2%。以上结果说明，本研究制备的胶体金二联检测卡作为一种早期快速筛选试剂，可以满足大规模检测的需求，具有较好的市场前景和应用价值。