基于Toll样受体4/核因子κB信号通路探究苦参碱对类风湿关节炎风湿热痹证的治疗作用及机制

周婷婷，杨文广，胡艳婷，马俊福

(1.商丘市中医院，河南 商丘 476000；2.河南省中医院，河南 郑州 450002)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜炎为主要病理表现的慢性系统性疾病，特征为手、足关节的对称性、侵袭性关节炎症，最终可导致关节畸形及功能丧失[1]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路被认为与RA有关[2]，调控该信号通路可作为RA的潜在治疗方向。RA属中医学痹证范围，风湿热痹证是其常见证候类型。苦参碱是从豆科植物苦参中提取的一种生物碱，具有抗病毒、抗炎和调节免疫等作用[3-4]。本研究拟通过建立RA风湿热痹证大鼠模型，研究苦参碱对RA风湿热痹证的治疗作用及作用机制，为临床治疗RA风湿热痹证提供参考。

1 材料与仪器

1.1 实验动物8周龄SPF级雄性SD大鼠60只，体质量180～200 g，购自北京科宇动物养殖中心，实验动物合格证号为SCXK(京)-2018-0010。适应性喂养7 d后开始实验。实验方案通过医院医学动物实验伦理委员会审查通过。

1.2 主要试剂牛Ⅱ型胶原(北京博蕾德生物科技有限公司)，弗氏完全佐剂(美国Sigma公司)，甲氨蝶呤(上海上药信谊药厂有限公司，每片2.5 mg)，苦参碱(纯度≥98%，美国Sigma公司)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA试剂盒(上海斯信生物科技有限公司)，HE染色液(北京索莱宝生物科技有限公司)，RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，山羊抗兔二抗IgG(上海碧云天生物技术有限公司)，兔抗大鼠NF-κB p65抗体、兔抗大鼠磷酸化核因子κB p65(phosphorylated nuclear factor-κB p65，p-NF-κB p65)抗体、兔抗大鼠TLR4抗体、兔抗大鼠Cleaved Caspase-3抗体、兔抗大鼠β-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.3 主要仪器YLS-7B型足趾容积测量仪(上海欣软信息科技有限公司)，生物组织自动脱水机、包埋机、石蜡切片机(德国Leica公司)，722型可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)，StepOnePlus实时定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

2 方 法

2.1 分组及造模将60只大鼠随机分为6组，每组10只。通过牛Ⅱ型胶原诱导[5]结合人工气候箱干预进行RA风湿热痹证造模。将50 mg牛Ⅱ型胶原冻干粉溶于25 mL冰醋酸溶液(0.1 mol·L-1)中，再与25 mL弗氏完全佐剂混合，配制成胶原乳化液。模型组、甲氨蝶呤组及苦参碱低、中、高剂量组大鼠，按照牛Ⅱ型胶原诱导法在背部脊柱两侧和尾根部分别注射胶原乳化液0.1 mL；注射结束后当天开始，将大鼠置于人工气候箱中进行干预，设置温度36 ℃、湿度95%、风速5 m·s-1，每天1次，每次1 h，连续7 d；第8天，在模型组、甲氨蝶呤组及苦参碱低、中、高剂量组大鼠左后肢足趾皮下注射0.1 mL胶原乳化液加强免疫，然后再放入人工气候箱继续干预(人工气候箱设置条件不变)，每天1次，每次1 h，连续7 d。正常组大鼠仅于相同时间点，在相同部位注射等量生理盐水，常规环境饲养。

2.2 药物干预自第2次人工气候箱干预开始后第2天起进行药物干预。甲氨蝶呤组大鼠按照1.0 mg·kg-1以甲氨蝶呤(蒸馏水配制)灌胃，苦参碱低、中、高剂量组大鼠分别按照30 mg·kg-1、60 mg·kg-1、120 mg·kg-1以苦参碱(蒸馏水配制)灌胃，正常组和模型组大鼠则以等体积蒸馏水灌胃。药物干预均每周1次，共干预4次。

2.3 实验指标检测

2.3.1大鼠一般情况观察 实验期间，观察大鼠与RA风湿热痹证相关表现的变化情况，如毛发光泽、饮食、行为活动、足趾肿胀等情况。

2.3.2足趾肿胀度测定 分别于造模前和药物干预结束后测定并计算大鼠的足趾肿胀度，具体方法如下：将大鼠左后足放入足趾容积测量仪，静止3 s后读数，测量3次取平均值，足趾肿胀度=(药物干预结束后足趾体积-造模前足趾体积)/造模前足趾体积。

2.3.3关节炎指数评定 分别于造模前和药物干预结束后，采用5级评分法[5]评定大鼠的关节炎指数：0分，正常；1分，足趾关节轻度发红或肿胀；2分，足趾关节以下部位肿胀；3分，踝关节以下全部肿胀；4分，整个足部肿胀或关节严重变形。以每只大鼠双后足评分之和作为最终评分。

2.3.4血清TNF-α、IL-1β含量测定 药物干预结束后当天，以2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，自腹主动脉取血2 mL，在4 ℃以3000 r·min-1离心10 min(离心半径8 cm)，收集上清液，于-80 ℃条件下保存。以ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β含量：包被抗体的聚苯乙烯酶标板经缓冲液清洗后，加入5%牛血清蛋白进行封闭；设置空白孔、标准孔和待测样品孔，标准孔加入稀释后的标准品50 μL、待测样品孔加入稀释液40 μL后再加入待测样品10 μL；除空白孔外，其余孔加辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，37 ℃ 孵育1 h；洗涤，加显色剂A和B各50 μL，37 ℃ 孵育20 min后加终止液 50 μL，终止反应；在450 nm检测吸光度值，根据标准品浓度和吸光度值绘制标准曲线，计算各组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量。

2.3.5膝关节滑膜组织病理学观察 腹主动脉取血后，脱颈处死大鼠，仰卧位固定，乙醇消毒后沿膝关节正中切开皮肤，暴露长3 cm、宽3 cm的区域，自髌骨上缘向下切开至股骨，再沿髌骨两侧向下分离至胫骨，剥离滑膜组织，部分在-80 ℃保存、部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。将在4%多聚甲醛溶液中固定24 h的滑膜组织取出，经脱水和透明处理后，以石蜡包埋切片，厚度5 μm，HE染色后置于显微镜下观察。

2.3.6膝关节滑膜组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达量检测 取部分于-80 ℃保存的大鼠膝关节滑膜组织，以实时定量PCR法测定滑膜组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA的表达量：以RNA提取试剂盒提取滑膜组织中目标基因的RNA，通过逆转录酶逆转录得到cDNA，以β-actin作为内参。PCR扩增条件为：预变性温度94 ℃、时间5 min，变性温度94 ℃、时间30 s，退火温度60 ℃、时间30 s，延伸温度72 ℃、时间1 min，共40个循环。以2-ΔΔCt法计算目标基因mRNA表达量。引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物序列

2.3.7膝关节滑膜组织Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白、NF-κB p65蛋白、p-NF-κB p65蛋白表达量检测 取部分于-80 ℃保存的大鼠膝关节滑膜组织，置于匀浆管中，加入RIPA裂解液裂解 20 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min(离心半径 8 cm)，取上清液以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定目标蛋白浓度。以Western Blot法测定Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达量：按20 μg蛋白量上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(80 V恒压电泳20 min，100 V恒压电泳90 min)，300 mA 恒流转膜1 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，滴加NF-κB p65(1∶1000)、p-NF-κB p65(1∶1000)、TLR4(1∶1000)、Cleaved caspase-3(1∶1000)、β-actin(1∶3000)一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜后滴加IgG二抗(1∶3000)，室温孵育1 h，洗膜后电化学发光显色，Image J软件测定灰度值，以β-actin为内参计算目标蛋白相对表达量。

2.4 数据统计采用SPSS23.0软件对数据进行统计分析。各组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数、血清TNF-α含量、血清IL-1β含量及膝关节滑膜组织Bax mRNA表达量、Bcl-2 mRNA表达量、TLR4 mRNA表达量、NF-κB p65 mRNA表达量、Cleavedcaspase-3蛋白表达量、TLR4蛋白表达量、NF-κB p65与p-NF-κB p65蛋白表达量比值的组间总体比较均采用单因素方差分析，组间两两比较均采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 大鼠一般情况正常组大鼠毛发顺滑有光泽，饮食、饮水正常，足趾无肿胀；造模后模型组、甲氨蝶呤组及苦参碱低、中、高剂量组大鼠均出现毛发干燥无光泽，摄水量增加，易激惹、攻击性强，足趾肿胀、红热、蜷缩、僵硬等表现；与模型组相比，药物干预后甲氨蝶呤组及苦参碱低、中、高剂量组大鼠毛发干燥无光泽、足趾肿胀等情况有所改善。

3.2 足趾肿胀度6组大鼠的足趾肿胀度比较，差异有统计学意义。模型组大鼠的足趾肿胀度高于其余5组(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)，苦参碱低剂量组大鼠的足趾肿胀度高于甲氨蝶呤组和苦参碱中、高剂量组(P=0.007；P=0.000；P=0.000)，苦参碱中剂量组大鼠的足趾肿胀度高于甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组(P=0.001；P=0.000)，甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组大鼠足趾肿胀度的差异无统计学意义(P=0.096)。见表2。

3.3 关节炎指数正常组大鼠足部未见异常，关节炎指数为0分；其余5组大鼠关节炎指数比较，差异有统计学意义。模型组大鼠的关节炎指数高于甲氨蝶呤组和苦参碱低、中、高剂量组(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)，苦参碱低剂量组大鼠的关节炎指数高于甲氨蝶呤组和苦参碱中、高剂量组(P=0.000；P=0.000；P=0.000)，苦参碱中剂量组大鼠的关节炎指数高于甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组(P=0.000；P=0.000)，甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组大鼠关节炎指数的差异无统计学意义(P=0.054)。见表2。

表2 6组大鼠的足趾肿胀度和关节炎指数

3.4 血清TNF-α、IL-1β含量6组大鼠的血清TNF-α、IL-1β含量比较，组间差异均有统计学意义。模型组大鼠的血清TNF-α、IL-1β含量均高于其余5组(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)，苦参碱低剂量组大鼠的血清TNF-α、IL-1β含量均高于甲氨蝶呤组和苦参碱中、高剂量组(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)，苦参碱中剂量组大鼠的血清TNF-α、IL-1β含量均高于甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)，甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组大鼠血清 TNF-α、IL-1β含量的差异均无统计学意义(P=0.054；P=0.067)。见表3。

表3 6组大鼠的血清肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β含量

3.5 膝关节滑膜组织病理学观察结果HE染色结果显示，正常组大鼠膝关节滑膜组织结构完整，细胞排列整齐，无炎症细胞浸润；与正常组相比，模型组大鼠滑膜组织增生明显，有大量炎症细胞浸润，滑膜细胞排列紊乱，边界模糊不清；与模型组相比，甲氨蝶呤组和苦参碱低、中、高剂量组滑膜组织增生程度减轻，滑膜细胞排列较整齐，炎症细胞浸润情况均得到不同程度改善(图1)。

图1 6组大鼠膝关节滑膜组织HE染色图(×200)

3.6 膝关节滑膜组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达量6组大鼠膝关节滑膜组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达量比较，组间差异均有统计学意义。模型组大鼠的膝关节滑膜组织Bax mRNA表达量低于其余5组(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)，Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达量均高于其余5组(P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.019，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000)；苦参碱低剂量组大鼠的膝关节滑膜组织Bax mRNA表达量低于甲氨蝶呤组和苦参碱中、高剂量组(P=0.000；P=0.000；P=0.000)，Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达量均高于甲氨蝶呤组及苦参碱中、高剂量组(P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000)；苦参碱中剂量组大鼠的膝关节滑膜组织Bax mRNA表达量低于甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组(P=0.000；P=0.000)，Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达量均高于甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组(P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.001)；甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组大鼠膝关节滑膜组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达量的组间差异均无统计学意义(P=0.755，P=0.074，P=0.096，P=0.096)。见表4。

表4 6组大鼠膝关节滑膜组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达量

3.7 膝关节滑膜组织Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白、NF-κB p65蛋白、p-NF-κB p65蛋白表达量6组大鼠的Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白表达量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达量比值比较，组间差异均有统计学意义。模型组大鼠的Cleaved caspase-3蛋白表达量低于其余5组(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)，TLR4蛋白表达量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达量比值均高于其余5组(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)；苦参碱低剂量组大鼠的Cleaved caspase-3蛋白表达量低于甲氨蝶呤组和苦参碱中、高剂量组(P=0.000；P=0.001；P=0.000)，TLR4蛋白表达量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达量比值均高于甲氨蝶呤组和苦参碱中、高剂量组(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)；苦参碱中剂量组大鼠的Cleaved caspase-3蛋白表达量低于甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组(P=0.000；P=0.000)，TLR4蛋白表达量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达量比值均高于甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)；甲氨蝶呤组和苦参碱高剂量组大鼠Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白表达量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达量比值的组间差异均无统计学意义(P=0.090，P=0.096，P=0.153)。见表5、图2。

表5 各组大鼠膝关节滑膜组织Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白表达量及NF-κB p65蛋白/p-NF-κB p65蛋白表达量比值

p-NF-κB p65为磷酸化核因子κB p65；NF-κB p65为核因子κB p65；TLR4为Toll样受体4；A为正常组；B为模型组；C为苦参碱低剂量组；D为苦参碱中剂量组；E为苦参碱高剂量组；F为甲氨蝶呤组。

4 讨 论

风湿热痹证是痹证的常见证候类型，其病邪性质为风、湿、热三邪[6]。活动期RA的证候以风湿热痹证为主，患者多见关节红肿、灼热、疼痛、喜冷恶热[7]。因此，治疗应以清热利湿，疏风止痛为主[8]。苦参碱具有清热解燥、去湿排毒以及抗炎等功效。研究发现，苦参碱能够减轻RA患者的压痛感，降低炎症因子水平[9]。苦参碱具有多种药理学活性，不仅可抑制宫颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭，而且可减轻前列腺炎大鼠炎症反应[10-11]。Niu等[12]研究发现，苦参碱可通过抑制NF-κB信号通路，调控RA中Th1/Th2细胞因子应答。还有研究发现，苦参碱可通过抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路，抑制胶原诱导的关节炎大鼠滑膜血管生成[13]。

本研究采用牛Ⅱ型胶原诱导联合人工气候箱干预，建立RA风湿热痹证大鼠模型。研究结果显示，模型组大鼠足趾肿胀度和关节炎指数较正常组明显升高，且滑膜组织增生明显，有大量炎症细胞浸润，滑膜细胞排列紊乱，滑膜边界弥散不清，提示模型制备成功。经苦参碱干预后，RA大鼠足趾肿胀度和关节炎指数明显降低，滑膜增生和炎症浸润情况得到改善，且改善效果存在剂量依赖性，但高剂量苦参碱的治疗效果与甲氨蝶呤无差别，提示苦参碱对RA风湿热痹证具有较好的治疗作用。本研究还发现，模型组大鼠血清TNF-α和IL-1β含量较正常组升高，干预后RA大鼠血清TNF-α和IL-1β含量降低，提示苦参碱可通过减轻RA大鼠的炎症反应改善其关节肿胀。

TLR4/NF-κB是免疫炎症损伤的重要信号通路，参与RA的发生发展[14-15]。NF-κB的激活可诱导TNF-α、IL-1β等炎症因子的释放[16-17]。实时定量PCR和Western Blot结果显示，模型组大鼠膝关节滑膜组织TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA、TLR4蛋白表达量均较正常组升高；而与模型组相比，苦参碱各剂量组的上述指标均明显降低。这表明TLR4/NF-κB信号通路参与了RA的发生发展，苦参碱可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路缓解RA的症状和体征。这与曲道炜等[18]的研究结论一致。p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达量比值反映了NF-κB p65蛋白的活化情况，模型组大鼠滑膜组织中该比值较正常组升高，说明NF-κB p65蛋白异常活化，TLR4/NF-κB信号通路被激活；苦参碱各剂量组该比值较模型组降低，说明苦参碱可抑制TLR4/NF-κB信号通路。TLR4/NF-κB信号通路的活化不仅会加剧炎症反应，还可促进滑膜细胞大量增殖，造成滑膜成纤维细胞凋亡不足[10,19]。Cleaved caspase-3是Caspase-3的活化形式，可诱导多种蛋白或酶类失活，改变细胞结构，加速细胞凋亡[11]。朱艳媚等[20]认为，可通过促进滑膜细胞凋亡减轻RA大鼠症状。本研究中，经苦参碱治疗后，RA大鼠滑膜组织Bax mRNA和Cleaved caspase-3蛋白表达水平均明显升高，Bcl-2 mRNA表达水平明显降低，提示苦参碱可促进滑膜细胞凋亡。

本研究的结果提示，苦参碱可有效减轻RA风湿热痹证大鼠的症状和体征，且疗效存在剂量依赖性；其作用机制可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻炎症反应、促进滑膜细胞凋亡。