宫颈癌患者中VEGF、OLFM4、miR-124表达水平及联合对复发预测价值分析

李惠彬，赵清平，余梦虹，钱 莹*，王 刚

(1.四川省崇州市妇幼保健院妇科，四川 崇州 611230；2.四川省妇幼保健院妇科，四川 成都 610000)

宫颈癌(cervical cancer，CC)是妇科常见的恶性肿瘤，其发病率高居女性恶性肿瘤第3位，仅次于乳腺癌及结直肠癌，已成为严重威胁女性健康的全球性问题[1]。近年我国CC的发生率逐渐增高，且呈现年轻化趋势，加强防治非常重要[2]。研究显示，CC的发生需要经过漫长的宫颈癌前病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)阶段，因此CIN阶段的检查和治疗是预防CC发生的关键环节[3-4]。有证据表明，血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)是促肿瘤血管产生的主要因子，其表达增加可促进肿瘤细胞增殖作用，在多种恶性肿瘤组织中呈高水平表达[5]。嗅觉介导素4(olfactomedin，OLFM4)是一种糖蛋白，可促进肿瘤细胞生长和发展转移，在CIN早期诊断方面具有良好应用价值[6]，但在CC中的研究较少。此外，微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)是与肿瘤发生发展密切相关的小分子核糖核酸，有报道指出miR-124具有抑制CC细胞增殖及迁移的能力[7]。基于此，本研究尝试探讨VEGF、OLFM4、miR-124检测在CC、CIN中的表达情况及临床意义，旨在为临床防治CC提供参考。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选取2015年10月—2018年10月于我院行手术治疗的CC患者82例为CC组，同期CIN患者82例为CIN组，正常宫颈组织标本82例为正常组。CC组年龄31～72岁，平均(52.16±9.91)岁；体重指数19.2～27.3，平均23.21±2.00；绝经情况为绝经45例，未绝经37例；合并症为高血压15例，糖尿病12例，高脂血症8例。CIN组年龄28～73岁，平均(50.83±11.08)岁；体重指数19.0～27.1，平均23.14±1.97；绝经情况为绝经42例，未绝经40例；合并症为高血压12例，糖尿病17例，高脂血症11例。正常组年龄26～70岁，平均(49.91±10.04)岁；体重指数18.8～26.7，平均22.87±1.91；绝经情况为绝经38例，未绝经44例；合并症为高血压17例，糖尿病10例，高脂血症6例。3组年龄、体重指数、绝经情况、合并症比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究经医院伦理委员会审批通过。所有患者及其家属均知情同意且签署知情同意书。

1.2纳入标准与排除标准 纳入标准：①CC标本、CIN标本、正常宫颈组织标本均经病理诊断确诊；标本均来自于子宫切除后宫颈标本；②患者宫颈完整，既往无宫颈手术或物理治疗史；③患者临床资料完整，能满足本研究需求。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②CC复发患者；③严重感染、脏器功能不全者；④合并其他恶性肿瘤者。

1.3方法 各组组织标本取得后即刻置于10%甲醛溶液中固定过夜，取组织标本，常规进行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，制片(4 μm)，采用罗氏公司生产的CINtec PLUS型全自动免疫组化分析仪，以免疫组织化学法测定各标本中VEGF、OLFM4阳性表达率，染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，采用BX51光学显微镜(日本奥林巴斯公司)下观察，每个切片随机选取5～10个高倍视野，每个视野计数100个瘤细胞，着色细胞<10%或无着色细胞为阴性(-)，着色细胞百分比≥10%为阳性(+)。取组织标本，采用实时荧光聚合酶链式反应检测miR-124水平，采用Trizol法提取总RNA，试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，采用美国Promega公司生产的逆转录试剂盒购将RNA反转录为cDNA，参照SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒(武汉科昊佳生物科技有限公司)说明书设计反应体系和反应条件，进行荧光聚合酶链式反应，miR-124正向引物为5′-GCTAAGGCACGCGGTG-3′，反向引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。内参基因为U6，U6正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。应用公式2-△△ct计算miR-124相对表达水平。

1.4观察指标 ①3组组织标本中VEGF、OLFM4、miR-124表达情况。②CC组不同病理参数(年龄、体重指数、临床分期、分化程度、肿瘤直径)患者组织标本中VEGF、OLFM4、miR-124表达阳性率，分析组织标本中各指标表达与CC组病理参数的关系。③CC组通过门诊或电话随访3年，统计3年内复发情况，比较3年复发与未复发患者组织标本中VEGF、OLFM4、miR-124表达情况。④分析VEGF、OLFM4、miR-124联合检测对复发预测价值。

1.5统计学方法 应用SPSS22.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验；计量资料比较采用独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验；采用Spearman相关系数模型分析相关性，采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13组组织标本中VEGF、OLFM4、miR-124表达 VEGF、OLFM4在CC组组织标本中阳性表达率均较CIN组和正常组高，miR-124在CC组组织标本中表达水平均较CIN组、正常组低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组组织标本中VEGF、OLFM4、miR-124表达比较

2.2CC组不同病理参数患者组织标本中VEGF、OLFM4、miR-124表达阳性率 CC组miR-124表达情况以、miR-124均值为界限，>均值判定为阳性，<均值判定为阴性。不同年龄、体重指数CC患者组织标本中VEGF、OLFM4、miR-124表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，且不同肿瘤直径CC患者组织标本中OLFM4、miR-124表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；有临床分期Ⅱ期、低分化患者组织标本中VEGF、OLFM4表达阳性率均高于临床分期Ⅰ期、高中分化患者，差异有统计学意义(P<0.05)，且肿瘤直径>4 cm患者组织标本中VEGF表达阳性率高于肿瘤直径≤4 cm患者，有临床分期Ⅱ期、低分化患者组织标本中miR-124表达阳性率均低于临床分期Ⅰ期、高中分化患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CC组不同病理参数患者组织标本中VEGF、OLFM4、miR-124表达阳性率比较

2.3组织标本中各指标表达与CC组病理参数的关系 Spearman相关分析可知，CC组VEGF、OLFM4、miR-124表达阳性率与年龄、体重之间无明显相关性，且肿瘤直径与OLFM4、miR-124表达阳性率无明显相关性(P>0.05)；CC组VEGF、OLFM4表达阳性率与分化程度呈负相关，与临床分期呈正相关，且组织标本中VEGF表达阳性率与肿瘤直径呈正相关(P<0.05)，组织标本中miR-124表达阳性率与分化程度呈正相关，与临床分期呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 组织标本中各指标表达与CC组病理参数的关系

2.4不同预后CC患者组织标本中各指标表达阳性率 3年复发患者组织标本中VEGF、OLFM4表达阳性率高于未复发患者，miR-124表达阳性率低于未复发患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同预后CC患者组织标本中各指标表达阳性率

2.5复发预测价值分析 VEGF、OLFM4、miR-124对复发的预测AUC分别为0.820、0.895、0.852，联合预测AUC为0.945，明显高于单一预测AUC。见图1。

图1 复发预测价值ROC曲线

3 讨 论

CC是目前唯一病因明确的妇科恶性肿瘤，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是引发CC的主要原因，其中90%以上为高危型HPV感染所致[8]。CC患者生物机制、病理类型等与其预后联系密切，因此加强与CC发生发展相关机制的研究，有助于疾病早期诊治。

VEGF是促进人体新生血管形成、增加血管通透性的重要糖蛋白，作为目前已知在肿瘤血管生成中作用最强的中介因子，其可经旁分泌作用于血管内皮细胞，促血管内皮细胞增殖、迁徙，从而加速新血管生成，增加肿瘤细胞周围血运，为肿瘤转移提供有利基础[9-10]。国内苏文芳[11]研究显示，CC组织标本中VEGF阳性表达率明显高于癌旁正常组织。Fu等[12]报道指出CC组织中VEGF的表达明显上调。本研究显示，CC组织标本中VEGF阳性表达率明显高于正常宫颈组织标本，与上述报道结果一致，且本研究进一步分析了CC与CIN组织标本中VEGF的表达差异，结果显示CC组织标本中VEGF阳性表达率明显升高，而CIN标本与正常宫颈组织标本中VEGF阳性差异无统计学意义，说明VEGF的表达升高可促进CC的发生，其作用可能是在CC早期体现，而在CIN阶段体现不明显，据此推测VEGF检测可用于CC早期诊断中。本研究还显示CC组织标本中OLFM4阳性表达率明显高于CIN及正常宫颈组织标本，且CIN组织标本中高于正常宫颈组织标本，说明OLFM4在CIN阶段即可能已经参与CC的发生发展。OLFM4属糖蛋白，具有抗细胞凋亡作用，OLFM4高水平表达可作用于S期、G2/M期DNA合成，加速细胞周期进程，促使肿瘤细胞增殖，同时能通过调节PI3K/PKB信号通路促肿瘤细胞生长，还能与细胞外黏附分子相互作用，参与肿瘤细胞的转移[13]。但既往有报道指出OLFM4在CIN2组织中的阳性表达率为94.0%，与在CC组织中的96.8%接近[14]，与本研究结果存在一定差异，这可能与CIN组织标本的选取不同有关，仍需通过大样本研究进一步验证。

此外，近年miRNA在恶性肿瘤发生进展中越来越受临床重视，miR-124属于miRNA的一种，有证据显示其在CC组织中的表达降低，能加速癌症病变，且与癌细胞过度增殖、凋亡不足、侵袭性生长密切相关[15]。本研究显示，CC组织标本中miR-124表达水平均低于CIN及正常宫颈组织标本，说明miR-124在CC组织中的表达明显降低，与上述报道结果一致。miR-124被证实是一种抑癌基因，具有抑制癌细胞增殖、迁移的功能[16]，其表达降低导致对CC细胞增殖及迁移的抑制作用减弱，最终引起CC。有报道认为miR-124抑癌作用可能与调节上皮-间充质转化活性有关，且能调节TRAF6等参与肿瘤的发生发展[17-18]。在以上研究结果基础上，本研究进一步分析了CC患者组织标本中VEGF、OLFM4及miR-124表达情况与患者病理参数的相关性，结果显示VEGF、OLFM4表达升高、miR-124表达降低与CC患者癌细胞增殖密切相关，且对预后复发具有一定的预测价值，且联合价值更高。

综上可知，CC患者癌组织中VEGF、OLFM4及miR-124表达情况与CC生物学行为密切相关，联合检测可有效预测肿瘤术后复发。但本研究仍存在一定不足，如未探究CC患者癌组织中VEGF、OLFM4、miR-124表达之间的关系，未能明确三者在CC发生发展中是否存在协同关系，未来工作中仍需深入探讨。