高效液相色谱-串联质谱法测定乳粉中壬基酚残留

白艳梅，张立佳，汪 洋，刘丽君，谢瑞龙，段建华，李翠枝

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

随着工业化的发展，越来越多的化学合成物产生，这些化学物质给人类带来方便的同时也会造成不可忽视的伤害。最近几年备受关注的环境污染物壬基酚是洗涤剂、纺织产品、皮革涂饰和包装材料中常见的化工原料。研究发现，壬基酚也是一种具有拟雌激素作用的环境污染物，不易降解，长期暴露在自然环境中可通过食物链进入人体，扰乱机体激素分泌，可导致人类性早熟及免疫力下降等，尤其是对刚发育的婴幼儿更加明显[1-2]。而最新研究发现，大鼠暴露于壬基酚环境中可增强肝脏、肾脏和心脏功能的损伤[3-4]。乳粉是婴幼儿的主要食物来源，乳粉安全对婴幼儿健康至关重要。食品及食品包装材料中禁止添加壬基酚，但乳粉的加工、运输、包装等各环节可能存在壬基酚污染的风险[5-8]。近几年壬基酚被各国列为环境污染物，并出台严格的管控标准，美国国家环保局推荐，淡水中壬基酚的含量不应高于6.6 µg/L，咸水中不应高于1.7 µg/L，目前我国食品中尚无限量标准。壬基酚作为环境污染物，容易引起食品安全风险，威胁着人民的身体健康，作为乳品企业，为保障人民的饮食健康，需制定严格的质量体系，监控每个环节，降低食品安全风险。虽然针对壬基酚的生态环境风险相关研究较多，但国内没有可依据的乳制品相关国家检测标准。2014年食药监食监三便函[2014]73号通知《国家食品安全监督抽检和风险监测》针对婴幼儿食品及食用植物油等食品指定了检验方法，该方法使用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）法净化处理，经研究发现，该方法对乳粉中包埋在内部的壬基酚提取效率较低。2019年国家市场监督管理总局发布食品补充检验方法BJS 201913《食品中辛基酚等5 种酚类物质的测定》，该方法采用塑料材质的固相萃取柱，具有本底污染严重、稳定性差等相关问题[9]。因此，亟需建立一种准确、稳定的乳粉中壬基酚检测方法。

壬基酚残留的检测方法主要为气相色谱-质谱法[10-13]、液相色谱-质谱法[14-16]等，检测对象主要为包装材料[17-20]、食品和环境水[21-23]等，其中气相色谱-质谱法对目标物进行衍生化处理，衍生化方法过程繁琐，前处理时间长，限制了该方法的使用。液相色谱-质谱法在大气压条件下电离，对目标物进行准确分析，灵敏度高、检测时间短，是目前检测壬基酚的常用方法。调研发现，检测乳粉中壬基酚的文献较多，如直接提取上机检测、有机试剂提取后凝胶色谱法除脂、冷冻除脂、塑料固相萃取柱除脂[24-28]等。直接提取法快速、简单但本底值高，基质效应强，污染检测仪器。凝胶色谱法除脂试剂消耗量大，检测成本高。冷冻除脂法耗时且除脂效果不明显。采用塑料固相萃取柱存在壬基酚溶出风险，导致本底值高，影响定量结果。本研究通过乳粉质控样进行方法准确性评价，解决了现行方法乳粉基质中壬基酚提取效率差、前处理流程复杂、操作时间长、有机试剂消耗量大、净化设备昂贵等不足。本研究建立一种使用高效液相色谱-串联质谱法检测乳粉中壬基酚的方法，对乳粉中的壬基酚残留量进行检测，为乳粉产品风险管控提供有力技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳粉为市场随机抽取的6 种乳粉；质控样为内蒙古伊利集团自主制备，壬基酚理论添加量33.36、300.00 µg/kg，每个添加量6 份。

二氯甲烷（色谱纯）、甲醇（液相色谱-质谱级）、乙腈（液相色谱-质谱级） 上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠（分析纯） 天津福晨化学试剂有限公司；4-壬基酚（纯度100%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；3,6,3-壬基酚-13C6内标（纯度100%） 默克化学试剂公司；水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水；ProElut PAEs Glass固相萃取柱（500 mg，6 mL） 迪马科技有限公司。

1.2 仪器与设备

QTRAP 6500高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪（配备电喷雾电离源） 美国AB Sciex公司；AL204分析天平（感量0.01 mg/0.1 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司；KQ-300DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；涡旋振荡器 德国IKA公司；Thermo冷冻离心机美国赛默飞公司；Biotage氮吹仪 瑞典拜泰齐公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

称取1 g试样（精确到0.1 mg），置于40 mL玻璃离心管中，加入3 mL 40～50 ℃温水将其充分溶解，准确加入100 μL 1 µg/mL 3,6,3-壬基酚-13C6内标中间液混匀，静置10 min，加入10 mL乙腈，涡旋振荡10 min，添加2 g氯化钠，涡旋振荡5 min使其充分混匀。超声提取15 min后，0～4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取上清液，待净化。

1.3.2 固相萃取净化

依次用6 mL二氯甲烷和6 mL乙腈活化固相萃取柱，取1.3.1节的上清液5 mL转移至固相萃取柱，自然流干，再用4 mL乙腈淋洗固相萃取柱，抽干，收集全部流出液置于玻璃离心管中，在40 ℃水浴下氮气吹干，1 mL甲醇复溶，0～4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取上清液上机分析。

实验中所用的器具均为玻璃材质，使用前用马弗炉400 ℃烘烤4 h。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）或其他等效柱；流速0.3 mL/min；进样量2 μL；柱温40 ℃；流动相A：超纯水，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.4 质谱分析条件

质谱条件：电喷雾离子源，负离子扫描模式；多反应监测；离子化电压-4 500 V；离子源温度500 ℃；辅助加热器压力50 psi（345 kPa）；喷雾气压力50 psi（345 kPa）。离子采集参数见表2。

表2 质谱参数Table 2 Mass spectrometric parameters

1.3.5 标准工作液配制

称取壬基酚10 mg，甲醇定容并稀释为100 µg/mL的标准溶液，-20 ℃保存。再将100 µg/mL的标准溶液用甲醇稀释至1 µg/mL，得壬基酚外标中间工作液，0～8 ℃保存，有效期3 个月。

精密量取3,6,3-壬基酚-13C6储备液1 mL，置于100 mL容量瓶，甲醇稀释、定容，得1 µg/mL壬基酚内标中间工作液，0～8 ℃保存，有效期3 个月。

混合标准工作液：分别准确吸取壬基酚中间工作液（1 µg/mL）适量，加入同位素内标中间工作液（1 µg/mL），逐级稀释得到系列标准工作液，质量浓度分别为2、5、10、20、40、80、100、200 ng/mL，质量浓度由低到高进行检测，以外标定量离子峰面积/内标离子峰面积-质量浓度作图，得到标准曲线回归方程。

1.3.6 结果计算

试样中壬基酚的含量按下式计算。

式中：X为试样中壬基酚残留量/（µg/kg）；ρ为试样上机溶液中壬基酚残留量/（ng/mL）；ρ0为空白实验中壬基酚残留量/（ng/mL）；V为样液最终定容体积/mL；n为稀释倍数；m为试样质量/g。

1.4 数据处理

利用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪Analyst工作站软件对壬基酚进行定性及定量分析，Excel软件对实验数据进行处理和统计学分析。

2 结果与分析

2.1 加水量的优化

称取1.0 g乳粉质控样（壬基酚含量300 µg/kg）各4 份，分别加入0、2、3、4 mL水，均加入10 mL乙腈，比较提取率。由图1可知，质控样采用乙腈直接提取的提取率较低，为40%～60%，随着水的加入，提取率呈上升趋势，加水量3、4 mL时提取率均达到100%左右，最终选择加水3 mL溶解。实验证明，加水后乳粉中的壬基酚更容易被乙腈溶剂提取，主要原因为乳粉为干性样品，加水后能使其充分溶解分散，加上乙腈的沉淀蛋白作用，使提取率明显提升。为了提高结果准确度，选择加水3 mL溶解后再进行提取。

图1 加水量对提取率的影响（n=6）Fig.1 Effect of the amount of added water on the extraction efficiency of nonylphenol (n = 6)

2.2 提取溶剂的优化

加标回收率是实验室在分析检测过程中常用的一种质量控制方式，当加标回收率在一定范围时，表明该分析方法适用[29]。取空白基质乳粉加入壬基酚标准工作液，壬基酚添加量为10 µg/kg，分别用乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）和乙腈提取后比较加标回收率。由表3可知，基质加标后分别用乙酸乙酯-环己烷和乙腈进行提取，加标回收率没有明显差异，均符合国标规定。

表3 壬基酚加标回收率比较（n=6）Table 3 Effect of extraction solvents on the recovery of nonylphenol (n = 6)

另取已知添加量的低、高浓度壬基酚乳粉质控样，分别选择乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）和乙腈2 种溶剂提取，比较质控样实际提取量。由表4可知，用乙酸乙酯-环己烷溶液和乙腈提取质控样，壬基酚测定结果差异较大，乙酸乙酯-环己烷溶液提取目标物效果较差，而乙腈提取效果明显改善。

表4 质控样提取率比较Table 4 Comparison of extraction efficiencies of different solvents for nonylphenol from quality control sample

乙酸乙酯-环己烷溶液提取率低的原因为主要检测游离态壬基酚，对乳粉包埋壬基酚提取效果较差。而当乙腈作为提取溶剂时，在有效提取目标物的同时具有沉淀蛋白的作用，对游离态壬基酚与包埋壬基酚提取效果均较优，综合考虑选用乙腈作为提取溶剂。

2.3 氯化钠添加量的选择

采用PAEs固相萃取柱，由于填料含硅胶，水会影响固相萃取柱的柱效，净化时需控制水量。利用氯化钠在乙腈中的溶解能力弱及易溶于水的性能，可以使两相分层，同时减少目标物在水中的溶解。称取1 g质控样（壬基酚含量300 µg/kg），加入3.0 mL水溶解，加入10 mL乙腈提取，加入不同质量的氯化钠（0、2、3、4 g），其余操作不变，比较提取效果。由图2可知，由于氯化钠的加入使乙腈层与水层分离明显，且壬基酚更完全地溶于乙腈层中，提高了提取效率。不加氯化钠时，壬基酚测定值为250 µg/kg，氯化钠添加量2、3 g时壬基酚提取效率明显提升。综合考虑，为了提高壬基酚测定结果准确度，选择氯化钠添加量2 g进行测定。

图2 氯化钠添加量对提取率的影响（n=6）Fig.2 Effect of the amount of added sodium chloride on the extraction efficiency of nonylphenol (n = 6)

2.4 净化条件的优化

通过阴性样品加标和乳粉质控样，考察PAEs玻璃固相萃取柱（PSA/硅胶串联，500 mg，6 mL）、炭黑固相萃取柱（Carbon，500 mg，6 mL）、聚苯乙烯-二乙烯基苯固相萃取柱（HLB，500 mg，6 mL）3 种固相萃取柱对结果的影响。由表5可知：HLB和Carbon固相萃取柱本底含量超过定量限（5.0 µg/kg），影响结果的准确性，而PAEs柱低于检出限（1 ng/mL）；PAEs固相萃取柱加标回收率和质控样回收率均为100%。HLB和Carbon固相萃取柱回收率和质控样回收率较低。为了提高方法的准确度，综合考虑，选择PAEs玻璃固相萃取柱进行前处理。

表5 3 种固相萃取柱的比较Table 5 Comparison of purification efficiencies of three kinds of solid phase extraction column

2.5 方法学评价

2.5.1 标准曲线、检出限和定量限

由表6可知，本方法的壬基酚标准曲线相关系数大于0.99，乳粉中壬基酚的定量限为5.0 µg/kg，满足信噪比（RS/N）≥10的要求。

表6 壬基酚标准曲线、检出限和定量限Table 6 Standard curve, limit of detection and limit of quantification for nonylphenol

2.5.2 方法的加标回收率和精密度

选取不含壬基酚的基质样品进行加标回收率实验，分别添加5、40、300 µg/kg共3 个水平的壬基酚标准溶液，每个加标水平做6 次平行实验。由表7可知，壬基酚的加标回收率为81.10%～107.39%，相对标准偏差为1.97%～9.73%，说明该方法测定乳粉中壬基酚残留时具有较好的准确度和精密度。

表7 壬基酚的加标回收率与相对标准偏差（n =6）Table 7 Recoveries and RSDs of nonylphenol from spiked sample (n = 6)

2.6 实际样品中壬基酚的测定

取市售的多品牌乳粉进行分析，样本数量40 个，壬基酚含量均小于5 µg/kg，表明目前大部分乳粉企业对工艺、运输及包装材料的控制非常严格，消费者可放心食用。

3 结 论

采用质控样进行检测方法的准确度评价，优化提取试剂和净化条件，提升了准确度和检测效率，采用同位素内标法建立高效液相色谱-串联质谱法测定乳粉中壬基酚的定量检测方法。结果表明，乳粉中壬基酚添加量5～300 µg/kg时，加标回收率为81.10%～107.39%，相对标准偏差为1.97%～9.73%，此方法具有较好的精密度和准确度。采用简单的固相萃取柱替换传统的凝胶色谱仪等昂贵的前处理设备，解决了乳粉基质中壬基酚提取率低的难题，前处理简单、节约成本、灵敏度高，适用于乳粉基质中的检测，为乳制品企业食品安全风险监测提供了技术保障。