气相色谱法测定乳粉中1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯含量的不确定度评定

刘春霞，段国霞，刘丽君，李翠枝，吕志勇，陈 静，宫慧丽，武伦玮

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

人乳脂的组成和结构比较特殊，从人乳脂脂肪酸组成来看，主要包括油酸、棕榈酸和亚油酸，分别占人乳脂的5%～35%、20%～30%、10%～20%。因此，由这3 种脂肪酸通过一定方式生成的1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯（1-oleic-2-palmitic-3-linoleic acid triglyceride，OPL）为U-S-U结构[1-4]，这种独特的结构可促进婴儿对脂肪和钙的吸收，并对脂代谢有显著影响[5-8]。为使婴幼儿获得与母乳相似的营养，需要对牛乳脂肪进行结构化改造，或采用结构油脂，使其甘油三酯的脂肪酸组成更接近母乳[9-12]。因此监测添加OPL的乳粉具有重要意义，在监测的同时，必须重视分析测试中的不确定度。2019年，中国合格评定国家认可委员会发布了新的测量不确定度要求，即开展检测的实验室应评定测量不确定度。不确定度的应用在我国各行各业分析测试中越来越受到重视[12-16]。不确定度是指由于测量误差的存在，对被测量值不能肯定的程度，不确定度越低，表明结果的可信程度越高，反之亦然，是一个衡量测量结果质量的指标。本研究对气相色谱法测定乳粉中OPL含量的不确定度进行探讨，该评定结果可直接应用于日常的实际检测工作。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳粉：市场随机抽取共6 种样品。

标准物质：OPL标准品（C55H100O6，纯度≥99%）北京曼哈格生物科技有限公司；石油醚、乙醚、无水乙醇（均为分析纯） 天津市富宇精细化工有限公司；氨水（优级纯）、氢氧化钾（分析纯） 天津盛奥化学试剂有限公司；正庚烷（色谱纯） 天津光复精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B气相色谱仪（配备氢火焰离子化检测器）美国安捷伦公司；AL204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；SuperVario-N多功能离心机 德国Funke Gerber公司；Pro UV超纯水机 美国赛默飞世尔公司；DZKW-4电热恒温水浴锅 北京兴伟仪器有限公司；MS 3 basic涡旋振荡器、RVID旋转蒸发仪 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 试样制备

1.3.1.1 样品水解

取乳粉试样约1.0 g至毛氏抽脂瓶中，加入10 mL（65±5） ℃的水溶解试样，振摇，使样品完全溶解，加入2 mL体积分数25%的氨水，置于60～70 ℃水浴中15～20 min，3～5 min振荡1 次，取出，冷却至室温，静置30 s。

1.3.1.2 脂肪提取

向冷却后的毛氏瓶中加入10 mL乙醇，加入2 滴1 g/100 mL刚果红，混匀。加入25 mL乙醚，塞上塞子，100 次/min振摇1 min。再加入25 mL石油醚，塞上塞子，100 次/min振摇30 s。500～600 r/min离心5 min，使醚层、水层分开。倾出上清液于250 mL圆底烧瓶中，为第1次提取。第2次提取加入的试剂为5 mL乙醇、15 mL乙醚、15 mL石油醚，操作同前，离心分层后倾出上清液与第1次上清液合并。第3次提取不加入乙醇，加入15 mL乙醚、15 mL石油醚，操作同前，离心分层后倾出上清液与前2 次上清液合并。

1.3.1.3 样液浓缩

把盛有脂肪上清液提取物的圆底烧瓶置于旋转蒸发器上，（60±2） ℃通入氮气旋转蒸发，浓缩至近干，用正己烷（或正庚烷）溶解残留物并定容至10 mL，用涡旋振荡器混匀，0.45 μm有机针式滤器过滤即为待测液。

1.3.2 标准溶液的配制

OPL标准储备液：准确称取10 mg OPL标准品（精确到0.1 mg），用正己烷（或正庚烷）溶解并定容至10 mL容量瓶中，制得OPL标准储备液（1 mg/mL），冷冻保存，有效期3 个月。

OPL标准工作液：吸取一定量OPL标准储备液，用正己烷（或正庚烷）定容，配制适宜质量浓度（500 μg/mL）的工作液，现用现配。

1.3.3 OPL含量计算

利用标样的质量浓度与峰面积，计算乳粉中OPL含量（X），按式（1）计算。计算结果保留3 位有效数字。

式中：A样为样品中OPL的峰面积；A标为OPL标样峰面积；ρ标为OPL标样质量浓度/（mg/mL）；V为定容体积/mL；m为待测样品质量/g；1 000、100为单位换算系数。

1.3.4 数学模型和不确定度评定

组合类似影响因素，将输入量ρ、V和m重复性因素组合在一起，归为输出量X的重复性因素，因此不需分别评定输入量ρ、V和m重复性引入的不确定度分量，而是直接评定测量结果（X）的重复性引入的不确定度分量。为此将式（1）改写为式（2）。

式中：ρ为根据标样求出的OPL溶液质量浓度/（mg/mL）；f为测量重复性影响因素的修正因子，其数值为1；ρ、V、m和f四者互不相关，采用方和根方法合成标准不确定度。而且OPL含量的计算式只有输入量ρ、V、m的积和商，因而用以下简化的方式计算合成标准不确定度[17-20]，如式（3）所示。

2 结果与分析

2.1 测量不确定度的来源分析

通过实验过程的标样、样品、重复性实验逐一分析，可知标样是通过称量和配制过程，样品是通过称量、定容、转移过程，重复性是通过称量重复性、定容重复性、提取重复性和上机重复性分别影响不确定度[21-23]。

2.2 输入量的标准不确定度评定

2.2.1urel（ρ）

urel（ρ）包括2 个来源：一是标准品称量引入的标准不确定度u1rel（ρ）；二是标准溶液配制过程引入的标准不确定度urel（VR1）。

2.2.1.1 标准品称量引入的相对标准不确定度分量u1rel（ρ）评定

标准品称量主要使用电子天平，因此，标准品称量引入的标准不确定度由电子天平检定后示值误差和偏载误差的最大允许误差决定。电子天平经检定合格，其示值误差最大允许误差为±0.05 mg，包含因子由此引起的标准不确定度u1s（m）

电子天平经检定合格，其偏载误差最大允许误差为±0.15 mg，包含因子为。由此引入的标准不确定度

故电子天平校准引入的标准不确定度u（m）按式（4）计算。

标准品质量m=0.011 30 g实际上是采用减量方法通过2 次测量相减给出的，所以u1rel（ρ）按式（5）计算。

2.2.1.2 标准品定容引入的相对标准不确定度分量urel（VR1）评定

配制储备液、样品定容时容量瓶校准引入的试样体积V的相对标准不确定度如下[24-27]：本研究使用的10 mL A级容量瓶的允许误差为0.02 mL，取三角分布，包含因子为，则容量瓶体积带来的不确定度u1（V）按式（6）计算。

相对标准不确定度urel（VR1）按式（7）计算。

综上，urel（ρ）按式（8）计算。

2.2.2urel（V）

urel（V）包括2 个来源：校准和重复性影响，重复性归入到OPL含量的重复性f中，只评定校准引入的标准不确定度。

样品定容、稀释时容量瓶校准引入的试样体积V的相对标准不确定度如下：本研究使用的10 mL A级容量瓶的允许误差为0.02 mL，取三角分布，包含因子为，则容量瓶体积带来的不确定度u1（V）按式（6）计算，为0.008 167 mL。相对标准不确定度urel（VR1）按式（7）计算，为0.000 816 7 mL。

本次测量过程中，样品使用10 mL容量瓶6 次，因此urel（V）按式（9）计算。

2.2.3urel（m）

质量m不是直接测量给出，实际上是采用减量法通过2 次称量给出的，即由1 次回零（空瓶）称量所得。每次测量不确定度都包括2 个来源：校准和重复性，重复性归入到OPL含量的重复性f中，只评定电子天平校准引入的标准不确定度u1（m）。

2.2.3.1u1（m）评定

电子天平校准引入的标准不确定度由电子天平检定后示值误差和偏载误差的最大允许误差决定。电子天平经检定合格，其示值误差最大允许误差为±0.5 mg，包含因子由此引入的标准不确定度按式（10）计算。

电子天平经检定合格，其偏载误差最大允许误差为±1 mg，包含因子由此引入的标准不确定度按式（11）计算。

故电子天平校准引入的标准不确定度u1（m）按式（12）计算。

2.2.3.2urel（m）的计算

urel（m）按式（13）计算。

2.2.4urel（f）

峰面积A测定引入的X的不确定度合并到urel（f）考虑，称取相同样品6 份，同时进行处理后在相同气相色谱条件下进行检测，6 份样品的测量结果平均值（X0）为1.172 g/100 g（表1），应用贝塞尔公式计算单次测量的实验标准差，按式（14）～（15）计算。

表1 6 份试样含量独立重复测定结果Table 1 Results of repeated determination of six samples

urel（f）按式（16）计算。

2.3 合成不确定度及扩展不确定度评定

2.3.1 输出量相对合成标准不确定度评定

将式（8）、（9）、（13）、（16）代入式（3），计算urel（X）[28-30]。

2.3.2 乳粉中OPL含量测定结果的扩展标准不确定度评定

取包含因子k=2，包含概率p≈95%，则含量测量结果的相对扩展不确定度urel为urel（X）×k=0.011 8×2=0.023 6。

2.3.3 OPL含量测量结果及不确定度报告

6 份试样OPL含量测量结果的平均值为1.172 g/100 g，OPL含量测量结果的相对扩展不确定度urel=0.023 6，提供约95%的包含概率。

3 结 论

OPL含量测量结果不确定度来源主要包含4 个方面，分别为：试样溶解并定容后的溶液质量浓度ρ引入的标准不确定度urel（ρ）；试样体积V定容引入的标准不确定度urel（V）；试样称量引入的标准不确定度urel（m）；OPL含量测量重复性引入的标准不确定度urel（f）。由以上评定过程可以看出，urel（ρ）是主要不确定度来源，由式（4）可以看出，标准溶液称量引入的相对标准不确定度分量是urel（ρ）的主要来源，由于本研究标准品称样量很小，计算结果也是通过在同一数量级的标样单点计算，所以严格控制称量环节，按照称量的标准规范进行操作，天平定期校准是控制本研究不确定度的有效手段。