气相色谱-质谱法测定发酵乳中氨基甲酸乙酯含量

2023-01-28陈同强吴海智荆辉华袁列江李凯龙

乳业科学与技术 2022年6期

陈同强，梁锋，吴海智，向俊,3，宋阳，荆辉华，袁列江，李灿，李凯龙

（1.湖南省产商品质量检验研究院，湖南长沙 410007；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙 410004；3.中南大学化学化工学院，湖南长沙 410083；4.湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南长沙 410125）

氨基甲酸乙酯是食品在发酵过程中较易产生的一类潜在性致癌化合物，可能会引起肺癌、肝癌等多种癌症[1-3]。食品中氨基甲酸乙酯的存在对人体健康存在一定的风险[4-6]，因此，准确测定食品中氨基甲酸乙酯含量对保障食品质量安全具有重要意义。

目前，食品中氨基甲酸乙酯的检测方法包括色谱法，如薄层色谱法[7]、高效液相色谱法[8-10]、气相色谱法[11]等，以及色谱-质谱联用法，如高相液相色谱-串联质谱法[12-18]、气相色谱-质谱联用法[19-22]、气相色谱-串联质谱法[23-24]等，但往往基于目标物含量低，食品基质本身复杂，氨基甲酸乙酯的检测常常需要进行有效前处理，如提取、净化、浓缩等[12,25-26]，因氨基甲酸乙酯本身属于小分子化合物，较易在浓缩阶段损失较大，造成检测灵敏度下降，因此，样品的前处理已成为检测食品中氨基甲酸乙酯的关键步骤[27-29]。现行GB 5009.223—2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》适用范围有限，仅适用于酒类、酱油等少数食品类别。本研究在国标基础上，通过优化提取、净化及浓缩等前处理步骤，建立气相色谱-质谱法测定发酵乳中氨基甲酸乙酯含量的方法，为保障发酵乳的质量安全提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氨基甲酸乙酯（色谱纯，纯度＞99%）、D5-氨基甲酸乙酯（色谱纯，纯度＞99%）、碱性硅藻土小柱（5 g，20 mL）上海安谱实验科技股份有限公司；其他所用试剂均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

TRACE1310-ISQ气相色谱-质谱仪美国赛默飞世尔科技公司；HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

D5-氨基甲酸乙酯标准储备液（1 000 μg/mL）：准确称取D5-氨基甲酸乙酯标准品10 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，涡旋混匀，4 ℃冰箱中保存。

D5-氨基甲酸乙酯标准使用液（10 μg/mL）：准确移取D5-氨基甲酸乙酯标准储备液（1 000 μg/mL）1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，涡旋混匀，4 ℃冰箱中保存。

氨基甲酸乙酯标准储备液（100 μg/mL）：准确称取氨基甲酸乙酯标准品10 mg置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，涡旋混匀，4 ℃冰箱中保存。

氨基甲酸乙酯标准中间液（0.5 μg/mL）：准确移取氨基甲酸乙酯标准储备液（100 μg/mL）0.5 mL于100 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，涡旋混匀，4 ℃冰箱中保存。

标准系列工作液：分别准确移取0.5 μg/mL氨基甲酸乙酯标准中间液0.02、0.04、0.10、0.20、0.40 mL于1.0 mL容量瓶中，各加入D5-氨基甲酸乙酯标准使用液（10 μg/mL）20 μL，甲醇定容，即得到质量浓度分别为10、20、50、100、200 ng/mL的标准系列工作液。

1.3.2 试样的制备

样品混匀，准确称取2.0 g于10 mL塑料离心管中，加水5 mL，再分别加入10 μg/mLD5-氨基甲酸乙酯标准使用液20 μL、氯化钠0.3 g，超声提取30 min，4 ℃、5 000 r/min离心5 min，吸取上清液至塑料离心管中，加5 mL正己烷，涡旋萃取2 min，弃正己烷层，取水层置于碱性硅藻土固相萃取柱，使样液缓慢渗透至填料中，静置10 min，用10 mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液经2 g无水硫酸钠脱水后，收集于10 mL塑料离心管中，35 ℃下减压浓缩至约0.5 mL，甲醇定容至1 mL，供气相色谱-质谱仪分析。

1.3.3 仪器条件

1.3.3.1 气相色谱条件

进样口温度220 ℃；炉温程序：初始温度50 ℃，保持1 min，以6 ℃/min速率升至180 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min速率升至240 ℃，保持2 min；载气：高纯氦气；设置流速为1.0 mL/min；进样方式：不分流，进样量1.0 μL。

1.3.3.2 质谱条件

电离方式：电子轰击离子源；离子源温度230 ℃；气相色谱-质谱仪接口温度280 ℃；监测方式：选择性离子监测（selected ion monitoring，SIM），监测离子如表1所示。

表1 目标物及内标的监测离子Table 1 Monitoring ions of target compound and internal standard

1.3.3.3 结果计算

式中：X为样品中氨基甲酸乙酯含量/（μg/kg）；ρ为测定液中氨基甲酸乙酯含量/（ng/mL）；V为样品测定液的定容体积/mL；m为样品质量/g。

1.4 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据处理及绘图。

2 结果与分析

2.1 提取方式的选择

样品常见的提取方式分为3 类：超声提取、索氏提取及液-液萃取。一般来说，索氏提取耗时较长，操作过程相对复杂，同时溶剂用量较大；液-液萃取方式，如处理不当，对于发酵乳样品来说极易乳化，极大降低提取效率；而超声提取则具备操作步骤简易、方便样品的大批量处理等优点，采用超声提取法提取30 min可保证发酵乳中氨基甲酸乙酯的加标回收率高达90%以上，因此，选择超声提取法较适宜。

2.2 洗脱溶剂的选择

GB 5009.223—2014以正己烷淋洗方式除杂，然而在实际操作过程中发现，净化处理前采用5 mL正己烷直接萃取可以更有效去除发酵乳中脂溶性杂质，大幅减少待测样品对仪器进样口端的污染。因此，本研究采用正己烷萃取代替正己烷淋洗除杂的操作过程。

国标选择体积分数5%乙酸乙酯-乙醚作为目标物洗脱剂，其中乙醚体积分数占到95%，因乙醚具有刺激性气味，且毒性较大，考虑到实验人员的健康安全，实验室应尽可能避免或减少这些试剂的使用。比较乙酸乙酯、体积分数50%乙酸乙酯-乙醚、体积分数5%乙酸乙酯-乙醚、乙醚4 种洗脱溶剂对发酵乳中氨基甲酸乙酯加标回收率的影响。

由图1可知，分别经4 种洗脱溶剂洗脱后，样品中氨基甲酸乙酯加标回收率相差无几，均在95%以上，考虑到乙醚的使用量，直接选择乙酸乙酯作为目标物的洗脱溶剂。

图1 洗脱溶剂对样品中氨基甲酸乙酯加标回收率的影响（n=3）Fig.1 Effect of elution solvents on the recovery of the added ethyl carbamate (n = 3)

2.3 内标物的选择

本方法使用的内标物为D5-氨基甲酸乙酯，其是与氨基甲酸乙酯具有相同分子结构的稳定同位素，且具有基本一致的物理化学性质，内标的加入能够有效消除基质效应及前处理等因素对分析结果的影响，在色谱分析中又能与待测物实现充分分离，尤为重要的是，D5-氨基甲酸乙酯作为一种人工合成物质，无法在生产过程中自然产生。这些特点使D5-氨基甲酸乙酯作为该检测方法的内标物，大大优于氨基甲酸丙酯等同类化合物。在预处理前加入内标物D5-氨基甲酸乙酯，当混合溶液中的待测物和内标物的含量比值维持恒定时，可以消除预处理过程中带入的不稳定性因素的影响。

2.4 色谱柱的选择

本研究选择的是HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），该色谱柱为一种超惰性色谱柱，不易与化合物之间产生吸附作用，固定相可采用溶剂冲洗，同时可耐受水溶液或含水溶液进样，分析时能够更加有效地分离氨基甲酸乙酯与内标物D5-氨基甲酸乙酯，提供对称的峰形及更强的响应。且该色谱柱可以检测其他酯类、醇类及酸类等化学成分，适用范围广泛，且适用性强。氨基甲酸乙酯与其内标物的峰形完整且完全分开。

2.5 标准谱图及线性关系

由图2可知，氨基甲酸乙酯与D5-氨基甲酸乙酯标准品色谱峰型均良好，且分离效果佳。在质量浓度0～200 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r＞0.999。

图2 氨基甲酸乙酯与D5-氨基甲酸乙酯标准品的SIM谱图Fig.2 SIM chromatograms of ethyl carbamate and D5-ethyl carbamate standard

2.6 检出限与定量限

向仪器注入一定浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液，观察噪音强度，将3 倍信噪比（RS/N）作为检出限最低响应值，通过稀释氨基甲酸乙酯标准溶液使其响应强度至3 倍RS/N，计算得到氨基甲酸乙酯检出限为2.0 μg/kg；稀释氨基甲酸乙酯标准溶液使其响应强度至10 倍RS/N，以10 倍RS/N作为其定量限最低响应值，计算得到定量限为5.0 μg/kg。结果表明，所建立的实验方法灵敏度较高。