尼古丁影响糖尿病心肌病进展的机制研究

赵 静，郭 蕊，孟芝君，刘彩红，谢耀丽，刘 晶，曹济民，王亚静

（1.山西医科大学基础医学院，山西 太原 030001；2.山西医科大学附属人民医院/山西省人民医院检验科，山西 太原 030001；3.山西医科大学第二医院内分泌科，山西 太原 030001）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的主要并发症之一，是由糖代谢紊乱引起以心脏结构和功能障碍为主要病理改变的一种特异性心肌病变[1]，早期表现为左心室僵硬，舒张功能和顺应性降低。随着时间延长及病变加重，患者逐渐出现心脏收缩功能受损，及其引起的呼吸困难等症状，最终发展为充血性心力衰竭。糖尿病患者数量的逐年增加导致DCM 的发病率和病死率持续攀升[2]。但是，目前DCM 诱发心脏重构和功能障碍的机制尚不清楚。吸烟是心血管疾病和2 型糖尿病的独立危险因素[3]。有研究指出[4]，吸烟者糖尿病患病风险增加26%。尼古丁是香烟烟雾的主要活性化合物之一[5]。长期暴露于高水平尼古丁是诱发和促发包括心肌病和周围血管疾病在内的心血管疾病的致病因素[6]。目前尼古丁促进DCM 的机制还有待明确。本研究通过3 大数据库（GEO 数据库、Drug bank 数据库、STRING 数据库）和WGCNA 分析对DCM 和尼古丁的相关基因进行筛选，旨在运用生物信息学技术分析探讨尼古丁对DCM 的影响及其作用机制，为吸烟人群中DCM 患者的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 资料来源 从GEO 公共数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载GSE4745 的Series Matrix File数据文件，注释平台为GPL85，共24 组转录组数据，正常组12 例，疾病组12 例；下载GSE99203 的Series Matrix File 数据文件，注释平台为GPL14745，共6 组转录组数据，包含正常组3 例，疾病组3 例；用SVA 算法进行芯片之间的数据矫正，探讨疾病相关分子机制的差异。

1.2 方法

1.2.1 WGCNA 分析 根据患者的表达谱数据构建WGCNA 网络，探讨DCM 中相关的共表达网络。通过构建加权基因共表达网络，寻找协同表达的基因模块，并探索基因网络与表型之间的关联关系以及网络中的关键基因。利用“WGCNA-R”包构建数据集中基因的共表达网络，筛选方差前10 000 的基因用该算法进行筛选，以便进一步分析，其中软阈值设置为9。将加权邻接矩阵转化为拓扑重叠度矩阵（TOM）来估计网络连接度，运用层次聚类的方法来构建TOM 矩阵的聚类树结构。聚类树的不同分支代表不同的基因模块，不同颜色代表不同的模块。基于基因的加权相关系数，将基因按照表达模式进行分类，模式相似的基因归为一个模块，最后，几万个基因通过基因表达模式被分成了多个模块。

1.2.2 尼古丁作用靶点分析 通过DrugBank 数据库（https://www.drugbank.ca/）检索尼古丁相关的靶基因。

1.2.3 hub 基因的确定 通过string 数据库（https://string-db.org/）查找药物相关的基因，并将置信度得分＞0.4 作为截点标准，得到113 个靶点相关的基因。将113 个靶点基因与WGCNA 中turquoise 模块的基因取交集，确定hub 基因。

1.2.4 免疫基因相关性 通过分析DCM 数据集中hub 基因与免疫浸润的关系，进一步探讨hub 基因影响DCM 进展的潜在分子机制。使用CIBERSORT算法对正常组和糖尿病组的患者RNA-seq 数据进行分析，用来推断样本免疫浸润细胞的相对比例。使用“corrplot”包分析免疫细胞之间的相互作用关系，进一步分析免疫细胞的作用关系的影响。采用“vioplot”包绘制免疫细胞的相对含量高低，评价基因对免疫浸润的影响，并对基因表达量以及免疫细胞含量进行Spearman 相关性分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。从TISIDB 数据库（http://cis.hku.hk/TISIDB/）获得chemokine、Immunoinhibitor、Immunostimulator、MHC、receptor 的相关基因，将核心基因与免疫相关基因进行pearson 相关性分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.2.5 GO 和KEGG 功能分析 利用R 包“clusterprofiler”对WGCNA 基因模块分析中的特定基因和2 个hub 基因进行GO 富集和KEGG 通路分析，使用Metascape数据库（http://metascape.org/）进行注释和可视化，Minoverlap ≥3 &P≤0.01 为统计学意义显著。

1.2.6 受试者工作特性曲线（ROC）评价核心靶点 通过使用R 语言（version 3.6）pROC 包绘制ROC 曲线，探讨靶点与DCM 发生发展的诊断效能关系，评价hub 基因与DCM 的关联程度。

1.2.7 hub 基因参与的miRNA-mRNA 调控网络和转录因子调控网络分析 通过Targetscan 数据库（http://www.targetscan.org/mamm_31/）分析hub 基因参与的miRNA-mRNA 调控网络，通过TRRUST 数据库（http://www.grnpedia.org/trrust/）将模块基因映射到转录因子（TF）调控网络中，得到模块基因-TF 调控关系，并用cytoscape 进行可视化。

1.3 统计学方法 采用R 语言（version 3.6）进行统计学分析，使用limma 软件包计算有关DCM 的两个数据集间的差异基因，应用WGCNA-R 软件包构建数据集中基因的共表达网络，利用clusterprofiler 软件包对WGCNA 基因模块分析中的特定基因和hub 基因进行GO 富集和KEGG 通路分析，应用pheatmap包分别分析和绘制免疫细胞表达热图，采用vioplot包绘制小提琴图，使用corrplot 包绘制不同免疫细胞间的占比相关图。免疫细胞含量差异分析采用Wilcoxon 检验、关键基因与免疫细胞的相关性用的是Spearman 检验，关键基因与免疫相关基因的相关性用的是Pearson 检验。运用pROC 软件包绘制ROC 曲线，探讨hub 基因与DCM 发生发展的诊断效能关系。所有统计检验均为双侧，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DCM 数据集差异基因的筛选 从GEO 数据库下载GSE4745 以及GSE99203 相关的数据集，共纳入30 例患者的表达谱数据，其中正常组15 例，疾病组15 例。使用SVA 算法对芯片进行矫正，用PCA 图展示矫正前后的差异情况。结果显示，SVA 算法矫正后芯片间批次效应消除（图1、图2）。进一步使用“limma”包计算两组患者之间的差异基因，随后提取出630 个差异基因绘制火山图，并用于后续构建WGCNA 网络（图3）。

图1 基因表达数据矫正前的PCA 图

图2 基因表达数据矫正后的PCA 图

图3 差异基因火山图

2.2 WGCNA 分析 首先，软阈值β 由函数“sft$powerEstimate”确定（图4A、4B），然后基于TOM 矩阵检测基因模块，在本次分析中共检测到3 个基因模块，分别为blue 模块（202）、grey 模块（31）、turquoise 模块（397）。进一步通过模块与性状之间的分析，发现turquoise 模块与表型相关性最高（cor=0.87，P=3e-10）（图4C）。对turquoise 模块的基因进行Metascape 通路分析，结果显示，基因主要富集在一元羧酸的代谢过程（monocarboxylic acid metabolic process）、对细胞外刺激的反应（response to extracellular stimulus）、硫化合物代谢过程（sulfur compound metabolic process）等通路（图4D）。

图4 WGCNA 表达谱数据中临床特征相关的关键模块及Metascape 通路分析

2.3 尼古丁相关靶点预测和hub 基因筛选 Drug bank 数据库检索出尼古丁作用靶点13 个，分别是CHAT、CYP19A1、CHRNB4、CHRNB3、CHRNA10、CHRNA9、CHRNA6、CHRNA5、CHRNA3、CHRNA2、CHRNB2、CHRNA7、CHRNA4；然后再通过STRING数据库查找靶点相关的基因，拓展不少于100 个数的基因调控网络，得到113 个靶点相关的基因网络（图5）。将113 个靶点基因与WGCNA 中turquoise模块的基因取交集，共得到2 个hub 基因Chrnb4、Cyp1a1（图6）。

图5 113 个尼古丁靶点相关基因调控网络

图6 确定hub 基因

2.4 尼古丁影响DCM 的hub 基因网络构建 GO 富集结果显示，2 个hub 基因主要涉及的通路为Fe3+反应[response to iron（III）ion]、维甲酸生物合成过程（retinoic acid biosynthetic process）（图7A）；KEGG富集结果显示，2 个hub 基因主要涉及的通路为色氨酸代谢（Tryptophan metabolism）、卵巢类固醇发生（Ovarian steroidogenesis）（图7B）。进一步使用Cytoscape 软件，生成了hub 基因影响DCM 的网络以及核心靶点相关通路的交互图，图表清晰显示2个hub 基因Chrnb4、Cyp1a1 的分子机制以及其对DCM的调控作用（图7C）。

图7 hub 基因网络构建

2.5 DCM 数据集及hub 基因的免疫浸润分析 通过分析在糖尿病心肌病数据集中核心基因与免疫浸润的关系，进一步探讨核心基因影响糖尿病心肌病进展的潜在分子机制。22 种免疫细胞热图显示一些免疫细胞，如M1 型巨噬细胞、中性粒细胞的细胞、B细胞、滤泡辅助性CD4+T 细胞、CD4+记忆性T 细胞、CD4+初始T 细胞、CD8+初始T 细胞、调节性T 细胞、Th17 细胞、未成熟的DC 细胞、活化的DC 细胞在正常组和疾病组中的细胞免疫浸润情况有较为明显的差异（图8A）。22 种免疫细胞相关性热图显示记忆B 细胞和初始B 细胞、CD8+初始T 细胞和CD4+初始T 细胞、CD4+记忆性T 细胞和Th17 细胞呈正相关，而调节性T 细胞和未成熟的DC 细胞、嗜酸性细胞和肥大细胞、滤泡辅助性CD4+T 细胞和活化的DC 细胞呈负相关（图8B）。小提琴图结果显示静息的NK 细胞、CD8+初始T 细胞、初始B细胞参与免疫浸润过程多。与正常对照组相比浆细胞、调节性T 细胞、静息的NK 细胞、中性粒细胞、未成熟的DC 细胞参与细胞免疫浸润过程较多，而嗜酸性细胞、肥大细胞、M1 巨噬细胞、活化的DC 细胞参与细胞免疫浸润过程较少（图8C）。2 个hub 基因均与免疫细胞含量有较强的相关性（图8D），结果符合预期。

图8 免疫浸润分析

2.6 hub 基因的免疫调控 hub 基因与免疫基因的相关性分析结果表明，Chrnb4 与Ccl20、Ccl11、Cxcl10、Il10、Cd28、Tap1、Cxcr5、Ccr3 呈正相关；Cyp1a1 与Ccl5、Cd48、Ccr5 呈负相关，见图9。

图9 hub 基因免疫调控结果

2.7 hub 基因的ROC 分析 2 个hub 基因的AUC 值分别是Chrnb4（AUC：0.707；95%CI：0.511～0.902）、Cyp1a1（AUC：0.769；95%CI：0.580～0.958），提示2个hub 基因均能较好的预测疾病的发生发展（图10A、10B）。

图10 ROC 分析结果

2.8 hub 基因的miRNA-mRNA 网络和TF 调控网络本研究共预测40 个miRNA-mRNA 作用关系对，其中35 个miRNA，2 个mRNA，见图11；hub 基因Cyp1a1 的转录调控网络见图12。

图11 hub 基因miRNA-RNA 共表达网络图

图12 Cyp1a1 转录调控网络

3 讨论

DCM 是糖尿病严重的心血管并发症，是目前临床实践中导致心力衰竭的主要原因之一，发病率和死亡率较高[7]。吸烟是糖尿病心肌病的主要危险因素，显著增加心脏病患病风险[8]。尼古丁是香烟烟雾的主要活性化合物之一，已被证明对心血管系统有不利影响。本研究通过3 大数据库（GEO 数据库、Drug bank 数据库、STRING 数据库）和WGCNA 分析对DCM 和尼古丁的相关基因进行分析筛选，分析尼古丁加重DCM 的潜在诊断生物标志物。

本研究从GEO 数据库下载DCM 的表达谱数据集，通过WGCNA 分析，构建加权基因共表达网络，基于TOM 矩阵检测基因模块，在本次分析中共检测到3 个基因模块，分别为blue（202）、grey（31）、turquoise（397）。进一步通过模块与性状之间的分析，发现turquoise 模块与表型相关性最高。对turquoise 模块的基因进行Metascape 通路分析，结果显示，基因主要富集在一元羧酸的代谢过程、对细胞外刺激的反应、硫化合物代谢过程等。表明这些生物学过程调控DCM 的发生与发展。

本研究根据WGCNA 分析、Drug bank 数据库和STRING 数据库，共得到2 个hub 基因Chrnb4、Cyp1a1，提示其可能为尼古丁影响DCM 的潜在靶点。使用Cytoscape 软件生成了hub 基因影响DCM的网络以及核心靶点相关通路的交互图，该图表清晰显示2 个hub 基因Chrnb4、Cyp1a1 的分子机制以及其对DCM 的调控作用。编码nAChRβ4 亚基的Chrnb4 基因广泛存在于气道上皮细胞，并形成异质nAchR 来调节尼古丁受体的亲和力。有研究证明激动剂1，1-二甲基-4-苯基哌嗪碘化（DMPP）选择性靶向α3β4 nAChr，通过增加棕色脂肪、心脏和骨骼肌中的葡萄糖摄取，显著改善了糖耐量[9]。此外，人类Chrnb4 基因中跨越MafA 结合区域的多态性与2型糖尿病相关[10]。Cyp1a1 参与了大量的外源性和内源性底物代谢，在药物和环境化学物质的代谢中起着关键作用。有研究表明在健康人心脏中，Cyp1a1 mRNA 的表达量极低，它对内源性底物代谢具有重要作用[11]。这些底物参与了氨基酸（AA）和色胺的代谢。慢性克山病和DCM 患者血液中Cyp1a1 和Cyp2c19 的mRNA 水平均高于健康人，说明心脏结构和功能损伤与AA 依赖的CYP 代谢途径之间可能存在因果关系[12]。有证据表明Cyp450 通过AA 的代谢调节心肌细胞的收缩性[13]。也有研究指出Cyp1a1的上调会加重心肌损伤[12]。

微环境主要由免疫细胞、细胞外基质、多种生长因子、炎症因子及特殊的理化特征等共同组成，显著影响着疾病的诊断和临床治疗敏感性。越来越多的证据表明，多种免疫细胞与DCM 的发生和进展密切相关。因此，本研究在前面分析结果的基础上采用CIBER-SORT 对DCM 及DCM 数据集中核心基因进行免疫细胞浸润分析，初步探讨免疫细胞浸润在DCM 中的作用并进一步探讨hub 基因影响DCM 进展的潜在分子机制。结果显示M1 型巨噬细胞、中性粒细胞的细胞、B 细胞、滤泡辅助性CD4+T 细胞、CD4+记忆性T 细胞、CD4+初始T 细胞、CD8+初始T细胞、调节性T 细胞、Th17 细胞、未成熟的DC 细胞、活化的DC 细胞在正常组和疾病组中的细胞免疫浸润情况有差异。说明这些免疫细胞在DCM 的发生和发展过程中起到了重要作用。同时，本研究结果显示，2 个hub 基因与免疫细胞含量有较强的相关性，说明2 个hub 基因是影响DCM 免疫浸润的候选基因。而控制炎症的始发因素，调控特定的细胞亚群或者相关的炎症通路可能预防或改善DCM 的进程和病理过程。有研究表明[14]，在胰岛素抵抗或肥胖状态下，M1 型巨噬细胞分泌炎症细胞因子，降低心脏和全身胰岛素信号，促进DCM 的发展。此外，与健康人群相比，糖尿病患者中性粒细胞对细胞因子和生长因子如IL-8、IL-1β、TNF-α 和IL-1ra表现出更高的反应和分泌水平，进一步促进中性粒细胞向炎症部位迁移、吞噬、溶解蛋白酶的释放、ROS 的产生和凋亡[15]。大量的实验和临床研究表明，适应性免疫，特别是T 淋巴细胞介导的免疫，在糖尿病和DCM 的发病机制中可能起着重要的作用。有研究报道[16]，T 细胞浸润与DCM 的风险增加有关，而在体外诱导DCM 实验中T 细胞的减少发挥心脏保护作用。在DCM 中T 细胞亚型异常改变，导致促炎和抗炎免疫失衡，从而调节炎症反应和胰岛素抵抗。据报道Th1 和Th17 亚群的增加促进DCM发展[17]。辅助性T 细胞分泌趋化因子、生长因子和促炎细胞因子的增加导致心脏功能受损和心脏纤维化增加，而调节性T 细胞（Treg）通常会减弱心脏辅助性T 细胞的促炎作用[18]。另一项研究报道[19]，Treg 细胞可通过抑多种途径抑制Th1 和Th17 反应，从而改善糖尿病患者的胰岛素抵抗。B 细胞介导的免疫可以促进自身免疫性糖尿病小鼠的心功能障碍[20]。本研究结果与上述研究相似，均表明DCM 发展过程中的免疫细胞活化的改变与心脏炎症增强有关。

免疫检查点是在免疫细胞上表达、能调节免疫激活程度的一系列分子，它们对防止自身免疫（免疫功能发生异常，对正常细胞发动攻击）作用的发生，起着重要作用。本研究免疫调控分析结果表明，Chrnb4 与Ccl20、Ccl11、Cxcl10、Il10、Cd28、Tap1、Cxcr5、Ccr3 呈 正 相 关；Cyp1a1 与Ccl5、Cd48、Ccr5呈负相关。表明这些免疫分子在DCM 病进展的过程中对hub 基因起到重要调控作用，这些分子的表达和功能异常是DCM 发生的重要原因之一，如果能针对这些免疫检查点分子进行调节，比如用靶向检查点分子的抑制剂就可以增强机体的免疫功能。ROC 分析显示，2 个2 个hub 基因的AUC 值分别是Chrnb4（AUC：0.707；95%CI：0.511～0.902）、Cyp1a1（AUC：0.769；95%CI：0.580～0.958），提示2 个hub基因均能较好的预测疾病的发生发展。由此推测Chrnb4 和Cyp1a1 可能参与DCM 的发生及进展，有望成为DCM 的潜在新型诊断生物学标志物。但仍需进一步实验验证。

随着分子生物学技术的发展，越来越多的证据表明，非编码RNA 参与糖尿病心肌病的分子机制[21]。基因表达受多个调控因子在不同水平上的调控，其中包括染色体修饰、DNA 甲基化、转录调控、mRNA的可变剪接及降解、转录后调控以及蛋白质修饰等。TF 和miRNA 作为2 种关键的调控因子在转录和转录后水平调控中发挥着至关重要的作用。以TF 和miRNA 为核心形成的调控网络已经被证实是一种有效的分析与研究生物调控复杂性的方法。研究TF与miRNA 组成的调控网络将对疾病的发生、发病机理在系统层次上提供重要的线索。因此，本研究在进一步通过Targetscan 数据库探讨2 个hub 基因参与的miRNA-mRNA 调控网络，结果共预测40 个miRNA-mRNA 作用关系对，其中35 个miRNA，2 个mRNA，这可能为今后转录因子与miRNA 调控通路的研究提供一定的理论基础。

综上所述，尼古丁可加重DCM 心肌病的进程，其与Chrnb4、Cyp1a1 相关并通过miRNA-RNA 互作调节免疫细胞含量，从而可为治疗吸烟人群中DCM患者心脏的损伤情况提供新的思路。