基于网络药理学探讨木防己汤治疗类风湿关节炎的作用机制

王宝娟，辛昊洋，李 月

（1.天津中医药大学第二附属医院肾病风湿科，天津 300150 2.天津市南开区广开街社区卫生服务中心，天津 300191）

木防己汤源于《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治篇》，为寒热并用、补泄兼施之剂，可通阳利水、清热补虚、消散饮邪积聚[1]。叶天士在《临症指南医案》中提出，“湿热流著，四肢痹痛”建议用仲景木防己汤法。后吴鞠通扩而充之，对木防己汤进行加减化裁，用于治疗暑湿痹证，称“此治痹之祖方也”。临床上类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）急性期多用此方治疗。网络药理学概念是2007 年英国药理学家Hopkins AL[2]提出，是在现代药理学研究的基础之上提出的药物设计与开发的新方法和新策略，其是以系统生物学为基础，从整体水平观察“药物－靶点－疾病”复杂网络关系[3]。本研究旨在通过网络药理学方法，探究木防己汤治疗类风湿关节炎的作用机制，以期为临床合理应用提供证据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 木防己汤有效成分及其作用靶点的筛选 于TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）收集木防己汤（防己、桂枝、人参、石膏）的有效成分信息和药理学信息，将有效成分汇总后与DrugBank（https：//go.drugbank.com）数据库里所有已知药物进行相似度比较，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性指数（drug-likeness，DL）≥0.18 为条件筛选有效成分。利用TCMSP 数据库筛选潜在蛋白靶点，并通过UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）将已筛选出来的靶蛋白名称标准化。

1.2 类风湿关节炎靶点的获取 利用GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）等数据库，以“Rheumatoid arthritis”为关键词，得到类风湿关节炎相关靶点。

1.3 网络构建及可视化

1.3.1 木防己汤-类风湿性关节炎的共同靶标基因的筛选 根据上述方法整理出相关靶点后，运用Venny2.1 软件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）筛选得出木防己汤中有效成分与类风湿性关节炎的共同靶点，并绘制Venny 图。采用Cytoscape3.7.2 构建木防己汤-有效成分-类风湿关节炎-交集靶点的生物网络。

1.3.2 蛋白互作网络（PPI）及核心靶点的确定 将共同靶标基因导入STRING 数据库（https://string-db.org/）,构建蛋白互作信息网络图。运用Cytoscape3.7.2软件对PPI 网络进行拓扑特征分析，最终筛选出核心靶点。

1.4 生物功能富集分析 运用R 语言软件（Rx64 4.0.4）对木防己汤与类风湿关节炎共同靶基因中的蛋白进行GO 功能富集分析和KEGG 信号通路分析，获得显著富集的信号通路（P＜0.05），导出柱状图，阐释木防己汤治疗RA 的作用机制。

2 结果

2.1 核心处方的有效成分及靶点预测 利用TCMSP数据库收集整理得到木防己汤有效成分，设定OB≥30%、DL≥0.18，共筛选得到32 个有效成分：防己3 个、桂枝7 个、人参22 个，去除重复项共得到30 个有效成分（见表1）。收集整理得到有效成分的潜在蛋白靶点377 个，其中防己47 个、桂枝74 个、人参256 个，去除重复值共得到125 个潜在蛋白靶点；利用UniProt 数据库把靶蛋白名称转换成对应的基因名称，去除重复值后得到56 个靶蛋白。石膏只有一个有效成分，无对应靶点蛋白。

表1 木防己汤有效活性化合物的相关信息

2.2 核心处方化学成分与类风湿关节炎相关的共同作用靶点筛选 通过Gene Cards 和HMIM 数据库进行检索，去除重复靶点后共搜集到与RA 相关的靶点5046 个。运用Venny 软件得到核心处方化学成分靶点（56 个）与RA 相关靶点（5046 个）的交集，包括PPARG、CASP3、ESR1、RELA、ICAM1 等37 个靶点。木防己汤治疗RA 的作用靶点见图1。

图1 木防己汤预测靶点与类风湿关节炎靶点韦恩图

2.3 PPI 网络构建及核心蛋白的确定 将筛选得到37 个木防己汤-类风湿关节炎相关的共同靶点蛋白质导入STRING 数据库，导出蛋白质与蛋白质相互作用数据网络图，见图2，该网络包含37 个蛋白，163 条关系线条，平均节点数8.81 条，预期边缘35 个，PPI 浓缩P＜1.0e-16。通过R 语言软件查询核心靶点，依据节点count 值，得到互作关系排名前20的靶点信息，导出barplot 条形图，见图3。对PPI 网络的靶点运用Cytoscape3.7.2 进行拓扑特征分析，以“度中心性”（degree）、“中介中心性”（betweenness）“接近中心性”（closeness）三个参数均大于中位数的条件来进行筛选，共筛选出15 个核心靶点，根据count 值 及PPI 拓 扑 特 征 分 析，PPARG、CASP3、RELA、ESR1、ICAM1 排名靠前，推测为核心基因。

图2 蛋白质互作PPI 网络图

图3 基因互作关系barplot 图

2.4 药物-化学成分-靶点-疾病共同作用靶点及关系网络构建 将获得的木防己汤-有效成分-靶点-类风湿关节炎数据利用Cytoscape3.7.2 网络绘图软件绘制并分析木防己汤干预类风湿性关节炎的成分-靶点网络图，见图4。菱形表示类风湿性关节炎，长方形代表木防己汤中的中药组成，三角形代表有效成分，六边形表示基因靶点。使用network analyzer 功能进行网络特征分析，以自由度（degree）值为评判标准可得出较为重要的成分、靶点，结果见表2。

表2 网络拓扑图分析表

图4 药物-化学成分-靶点-疾病靶点网络图

2.5 生物功能富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 GO 功能富集共包括83个GO 条目，根据P 值将82 个GO 条目进行升序排列，筛选前20 个条目，导出柱状图，见图6。柱状图Y 轴代表GO 名称，X 轴表示富集的基因数目，生物过程主要涉及nuclear receptor activity、ligandactivated transcription factor activity、transcription coactivator binding、cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway、cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process 等。

图6 GO 功能富集分析柱状图

2.5.2 KEGG 通路富集分析 KEGG 信号通路共确定90 条信号通路，筛选出富集基因数的前20 条通路（见图7）。柱状图Y 轴代表KEGG 通路名称，X 轴表示富集的基因数目，信号通路主要包括Lipid and atherosclerosis、TNF signaling pathway、Toxoplasmosis、Chemical carcinogenesis -receptor activation、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Influenza A、Apoptosis。

图7 KEGG 富集分析柱状图

3 讨论

RA 在中医上属于“痹证”的范畴，急性期多为湿热痹[4]，临床使用木防己汤治疗有效[5-7]。RA 发生发展过程由多种信号分子和多条生物通路调控。本研究采用网络药理学方法，通过分析木防己汤的有效成分、作用靶点及调控的信号通路，建立该方治疗RA 的“成分-靶点-信号通路”多层次网络模型，探讨了木防己汤治疗类风湿关节炎的主要机制。

本研究发现在木防己汤-有效成分-靶点-信号通路网络中β-谷甾醇、山柰酚关联度最高。β-谷甾醇有抗炎作用，Liu R 等[8]研究发现，β-谷甾醇通过调节巨噬细胞极化减轻胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠踝关节肿胀症状，降低胶原特异性抗体并抑制促炎因子的产生。Guo Q等[9]研究表明，β-谷甾醇和欧前胡素能够协同作用于CIA 大鼠，改善其关节炎的严重程度，协同机制与调节LTA、CD83 和SREBF1 的水平密切相关。Zhang F等[10]研究发现β-谷甾醇通过增加滑膜的氧化还原状态水平并减少TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17，增加TGF-β、IL-10 等细胞因子，抑制NF-kB和激活HO-1/Nrf-2 通路显示出对CFA 大鼠的抗关节炎作用。山柰酚有抗炎和免疫调节特性，山柰酚可双向调节Treg 细胞的免疫抑制和Th 细胞的促炎作用，同时可抑制滑膜异常增厚，调节相关信号通路，抑制骨侵蚀和血管生成[11]。其可降低破骨细胞的分化，并通过靶向成纤维细胞生长因子受体3-核糖体S6 激酶2 信号轴防止类风湿性关节炎的发展[12]。β-谷甾醇和山柰酚有抗炎和免疫调节作用，因此推断木防己汤治疗RA 发挥作用的主要成分可能为β-谷甾醇、山柰酚等。

本研究运用网络药理学技术预测木防己汤治疗类风湿关节炎有37 个潜在作用靶点。筛选出15 个核心靶点，其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、RELA、雌激素受体R1（ESR1）、细胞间黏附分子-1（ICAM1）等靶点排名靠前，推测为核心靶点。PPARG 属于核受体超家族，和其他核受体超家族一样，可调节细胞分化、发育和代谢。此外，它还涉及脂质代谢的调节以及单核细胞、巨噬细胞的成熟和炎症反应的控制[13]。Baroi S 等[14]研究发现，骨细胞中的PPARG 能够控制硬化蛋白表达、骨量、骨髓肥胖并介导罗格列酮诱导的骨质流失。Hu YH 等[15]发现炎症反应时可以导致AIA 大鼠脂肪合成不足，调节PPARG 恢复脂肪代谢的稳态，可以阻止AIA 大鼠单核细胞/巨噬细胞糖酵解引起的炎症极化。RELA 翻译后修饰可精准调控NF-κB 的转录活性，在调节炎症、肿瘤、代谢以及免疫应答等重要的生命活动及相关疾病的发生发展过程中起重要作用。RelA 通过调控NLRP3 的转录，促进巨噬细胞中NLRP3 炎症小体的形成，进而调控RA 关节滑膜的炎症反应[16]。ESR1 可表达于成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞和骨髓基质细胞以及骨细胞，与很多骨性疾病密切相关。ESR1 基因在RA患者中存在差异表达，预测其可作为治疗RA 的新靶点[17]。ICAM1 又叫做CD54 是介导黏附反应重要的一个黏附分子，它在炎症反应、控制肿瘤恶化和转移以及调节机体免疫反应中起重要作用[18，19]。

在木防己汤治疗RA 的GO 分析中，主要涉及核受体活性、配体激活转录因子活性、转录辅激活子结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡信号通路、半胱氨酸型内肽酶与细胞凋亡过程等。通过KEGG 分析得出20 条通路，包括脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、弓形虫病（toxoplasmosis）、化学致癌-受体激活（chemical carcinogenesis-receptor activation）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、前列腺癌（prostate cancer）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）、甲型流感（Influenza A）、细胞凋亡（apoptosis）等信号通路，这些通路可能是木防己汤治疗RA 的作用机制。

自身免疫性疾病与动脉粥样硬化有着密切的联系[20]，高脂血症环境激活了致病性自身免疫性细胞反应，从而促进了自身免疫性疾病。推测木防己汤可能会通过调控脂质和动脉粥样硬化信号通路影响RA 患者体内脂质代谢，抑制炎症反应和免疫细胞，减轻患者的炎性症状。

TNF 作为一种关键的细胞因子，可以诱导广泛的细胞内信号通路，包括细胞凋亡、炎症和免疫。其在RA 患者的关节滑液和滑膜组织中的表达明显上升，可影响滑膜巨噬细胞、滑膜细胞、软骨细胞和破骨细胞等，进而改变关节微环境，进一步加重关节破坏[21]。已有实验证实[22]，木防己汤能够降低血清TNF-α 含量，从而缓解RA 病情，减轻关节水肿，减少淋巴细胞浸润，抑制滑膜增生。结合研究结果，考虑木防己汤可能通过抑制TNF 信号通路缓解疾病。

细胞凋亡指细胞为了抵抗外界刺激，维持内部环境的稳态而发生的非依赖性有序死亡，通常被称为程序性死亡。与其他细胞死亡方式不同，细胞凋亡是一种自我保护机制[23]。诱导FLS 细胞凋亡是中药治疗RA 的重要机制，可能与死亡受体介导的凋亡通路、线粒体依赖的凋亡通路、NF-κB 介导的凋亡通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）介导的凋亡通路、内质网应激（ERS）介导的凋亡通路及PI3K-Akt介导的凋亡途径有关[24]。研究发现[25]，复方木防己汤可能通过抑制C-myc 活化，介导细胞凋亡。推断木防己汤可能通过每种途径参与FLS 细胞凋亡的过程，需要深入的实验研究来加以验证。

RA 患者RAGE 表达增加，IL-17 和IL-1β 表达增加[26]。这表明抑制RAGE 可能是RA 治疗的一个良好靶点。而木防己汤也有可能干预了糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路。RA 的病因不明确，可能与遗传、感染、环境和内分泌因素有关，病毒感染被认为是自身免疫疾病的一个重要原因。甲型流感病毒（IAV）是其一，病毒感染可诱导或预防自身免疫性疾病[27]。慢性乙肝病毒感染可能有关节痛或与RA 相似的关节炎[28]。有研究报道称[29]，HBV 感染和RA 患者病理改变具有一定联系。弓形虫可能引发个体的病理过程，最终导致RA[30]。弓形虫增加了患者体内IL-17 的表达，这种细胞因子参与了RA的发病。木防己汤是否可以通过抗病毒、抗寄生虫途径等治疗RA，有待更深入的研究。

恶性肿瘤是RA 的共病疾病，相关性研究中发现，无肿瘤时淋巴瘤与RA 的相关性最高[31]，但与其他肿瘤相关性并不一致，NHANES 的人口数据分析支持RA 患者癌症风险增加，乳腺癌和前列腺癌是最常见的癌症类型[32]，但具体原因不明，可能与炎症反应或者免疫药物应用有关。通路富集分析显示木防己汤可能通过调控脂质代谢和抗动脉硬化、TNF信号通路、促进细胞凋亡、抗病毒、抗寄生虫、肿瘤相关通路等方面治疗RA。

综上所述，木防己汤对RA 的治疗呈现多成分、多靶点、多通路的特点，研究结果初步推测木防己汤有效活性成分治疗RA 的作用机制，但本研究仅从网络药理学层面分析，而对其临床作用机制了解仍不足，因此有必要通过实验研究来进一步深入探究，为木防己汤治疗RA 提供理论依据。