UPLC-Q-TOF-MS 联合网络药理学分析滇黄芩抗菌的潜在药效物质及作用机制

陈 威，梁 新，苏 捷，陈琦松，陈佳婧，朱丽君，雷 昌

（1.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室（培育），云南 大理 671000；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

滇黄芩（Scutellaria amoena）为唇形科黄芩属植物的干燥根，是云南道地药材，药用历史悠久，为白族、彝族、僳僳族、藏族、纳西族等少数民族的药用资源[1]，其性寒，味苦，归肺、胃、胆、肝、大肠路，具有清肺胃热、燥湿气、解毒、消炎、止血、安胎、降脂等功效[2，3]。有研究表明[4]，滇黄芩对临床常见的金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等多种致病微生物均有不同程度的抑制作用，但对滇黄芩发挥抗菌作用的药效物质及作用机制尚缺乏整体认识，导致无法系统评估其潜在的应用价值与替代黄芩药用的合理性，限制了其进一步的应用和推广。超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography -quadrupole -time -of -flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技术是液质联用分析技术在近年的一个新进展，能够灵敏、可靠、快速全面地对中药多成分体系进行鉴定与分析；网络药理学是一门与中医药整体观、辨证论治原则相吻合的新兴药理学分支学科[5，6]，通过利用相关数据库和计算机软件，构建“中药-活性成分-靶点-通路”的机制网络，具有整体性、系统性的特点；两者结合可初步阐明复方制剂体内“多成分-多靶点-多通路”作用机制，近年来已被广泛用于中药药效物质及作用机制研究领域[7-9]。本研究主要采用UPLC-Q-TOFMS 技术、网络药理学分析滇黄芩抗菌的潜在药效物质及作用机制，以期为滇黄芩抗菌的药效物质及作用机制的进一步研究提供新的思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Acquity 超高效液相色谱仪、Xevo G2-XS 型四级杆飞行时间质谱仪、离子源为双源电喷雾离子源（美国Waters 公司），超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司），万分之一电子分析天平（梅特勒）。水为屈臣氏蒸馏水，乙腈为质谱纯，甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。滇黄芩植物样品于2019 年8 月采自云南省大理州洱源县，经大理大学药物研究所肖朝江博士鉴定为滇黄芩（Scutellaria amoenaC.H.Wright）。

1.2 滇黄芩化学成分分析 ①滇黄芩提取物的制备[4]：取滇黄芩10 g，粉碎后分别以85%乙醇200 ml 冷浸提取3 次，24 h/次，再以超声提取2 次，30 min/次，合并提取液，减压浓缩，冻干，即得滇黄芩提取物冻干粉；②供试品溶液的制备：精密称定滇黄芩提取物3.0 mg，置具塞锥形瓶中，加入色谱甲醇20 ml，超声（功率250 W，频率53 kHz）提取20 min，放冷，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；③色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～4 min，5%～16%A；4～13 min，16%～48%A；13～20 min，47%～64%A；20～27 min，64%～89% A；27～30 min，89%～100%A；30～32 min，100%～5%A；32～33 min，5%A)，流速0.4 ml/min，柱温35 ℃，进样量3 μl；④质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），正、负离子2 种模式进行检测。质谱数据格式为Continuum，雾化气（N2）流速为800 L/h，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度600 ℃，毛细管电压2.5 kV。锥孔电压（sampling cone）40 V，补偿电压（source offset）80 V，气帘气流速（cone gas flows）为50 L/h，质量扫描范围为100～1200 m/z，内参校准液亮氨酸-脑啡肽（554.2615 m/z）作为相对分子质量实时校正。

1.3 网络药理学分析

1.3.1 滇黄芩抗菌作用靶点的预测 通过中药药理学技术平台（TCMSP 数据库）对UPLC-Q-TOF-MS 技术鉴定的滇黄芩化合物检索查询，同时在“Related Targets”页面中将上述化合物编号导入，得到滇黄芩化学成分的靶标蛋白。将获得的化合物靶点信息导入Uniport 数据库（https://www.uniprot.org/），借助STRING（https://string-db.org/）中Multiple proteins 搜索功能以及UniProt（http://www.uniprot.org/）中UniProtKB 搜索功能，输入蛋白质名称，物种选择为“Homo sapiens”，进行标准化，下载结果。在GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库中检索抗菌相关靶点，将结果导入Excel，与滇黄芩成分靶点一同导入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中进行映射，记录二者的交集部分，绘制韦恩图。

1.3.2 蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将上述筛选所得到潜在靶点输入STRING 数据库，限制物种为“Homo sapiens”，置信度为中等0.04，得到PPI 核心网络，并将结果以TSV 文件导入Cytoscape 3.6.1，导出相应的拓扑参数值，得到PPI 图。

1.3.3 GO 功能与模块分析、KEGG 富集通路分析 将筛选出的滇黄芩抗菌的潜在靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），限制物种条件为“Homo sapiens”，阈值P＜0.05，采取基因本体论（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，再用Graph－Pad Prism 7 和在线绘图网站imageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index）将结果可视化。

1.3.4 滇黄芩“活性成分-靶点网络-通路”网络的构建 利用Cytoscape 3.6.1（https://cytoscape.org/）软件，构建滇黄芩活性成分-靶点-通路网络，分析化合物和靶点间的度（degree）值关系，其中节点代表化学成分、靶点和信号通路，边用来连接化学成分、靶点和信号通路。

1.3.5 分子对接验证 选取度值较为靠前的成分及靶点对其进行分子对接。在TCMSP 平台下载活性成分结构的mol2 格式文件，并在PBD（https://www.rcsb.org/）数据库下载相应靶点3D 结构的pdb 文件，运用AutoDock4.2.6 软件，对靶点及活性成分进行分子对接分析，并使用PyMol2.4.1 软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 滇黄芩的主要化学成分 通过UPLC-Q-TOFMS 技术分析得滇黄芩总离子流色谱图，见图1。采用MassLynx V4.1 软件提取总离子流色谱图，获取化学成分的保留时间、质谱准分子离子峰和碎片离子峰等信息，参考自检数据库和相关文献，推测化学成分，结果在滇黄芩中共鉴定21 个化学成分，UPLC-Q-TOF/MS 数据见表1。

表1 滇黄芩化学成分的UPLC-Q-TOF-MS 鉴定

图1 滇黄芩在正离子和负离子模式下的总离子流

2.2 网络药理学分析结果

2.2.1 滇黄芩中化合物与抗菌作用的交集基因 通过TCMSP 获取各活性成分作用靶点，查询结果包括滇黄芩122 个无重复靶点。通过Gene Cards 查询获得抗菌作用靶点1895 个，无重复靶点。由在线韦恩图可知，滇黄芩中化合物与抗菌作用的交集基因有67 个，借助Venny 2.1.0 将结果可视化，结果见图2。

图2 滇黄芩中化合物及其与抗菌作用相关靶点的交集基因

2.2.2 蛋白-蛋白相互作用网络的构建 凭借STRING和Cytoscape 3.6.1 构建交集基因的蛋白质相互作用（PPI），网络含有72 个节点和2034 条边。对网络发展中所存在的各个点的拓扑参数进行研究分析，得到节点度值27，故以大于等于2 倍度值进行筛选分析，得 到PTGS2、CASP9、AKT1、HSP90AA1、TP53、JUN 等为主的35 个关键靶点，见图3。

图3 滇黄芩与抗菌蛋白质相互作用核心网络(PPICN)

2.2.3 生物过程和通路富集分析 DAVID 中GO 功能富集分析中获得的GO 条目共288 个（P＜0.05），其中包括生物过程条目230 个，涉及对药物的反应、DNA 模板转录的正调控、凋亡过程的负调节等；细胞组成条目17 个，涉及细胞外间隙、细胞溶质、质膜等；分子功能条目41 个，涉及酶结合、蛋白结合、转录因子结合等。该结果中生物过程、细胞成分和分子功能分别占79.9%、5.9%和14.2%，运用GraphPad Prism 7 对生物通路结果进行可视化处理，结果见图4。KEGG 通路富集分析共获得88 条信号通路（P＜0.05），涉及HIF-1、TNF、p53 和FoxO 信号通路等，选取排名靠前的通路绘制气泡图，结果见图5。

图4 滇黄芩活性成分潜在靶点的GO 生物学过程富集分析

图5 滇黄芩活性成分潜在抗菌靶点的KEGG 代谢通路富集分析

2.2.4 滇黄芩“活性成分-靶点-通路”网络的构建 构建主要成分-靶点-通路网络，其中“菱形”代表通路，“三角形”代表抗菌作用靶点，“V 形”代表化学成分，该网络由65 个节点，包括10 种成分、35 个靶点、10 条通路和294 条边，其中化学成分芹菜素、黄芩素、5，7，4'-三羟基-8-甲氧基黄酮等节点较大，表明与其相连的节点较多，可能是重要活性成分；另外，PTGS2、HSP90AA1、CASP9 等靶点节点较大，可能是重要作用靶点，其中HIF-1、TNF、p53 等通路可能是重要通路，见图6。

图6 滇黄芩活性成分-靶点-通路网络图

2.2.5 分子对接结果 将度值靠前的活性成分芹菜素、黄芩素、5，7，4'-三羟基-8-甲氧基黄酮与潜在活性成分中度值较为靠前的PTGS2、HSP90AA1、CASP9 以及NFKBIA 进行分子对接，结果显示所有靶点与分子均对接成功，见表2。结合能数值越小，则结合越稳定，本研究选取结合最稳定的对接结果见图7。

表2 滇黄芩活性成分与靶点分子对接结果

图7 滇黄芩活性成分与靶点分子的对接结果

3 讨论

课题组前期对滇黄芩做过抗菌活性研究[4]，但缺少对其药效物质基础及作用机制的系统探讨。UPLC-Q-TOF-MS 技术是分析中药药效的强有力工具，在没有标准品的条件下，通过采用串联质谱分析化合物的一级和二级质谱信息，可以大致推测其化合物结构和类型，从而进行定性分析。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技术对滇黄芩的化学成分进行分析，鉴定出了21 个主要化学成分，以黄酮类化合物为主，提示滇黄芩抗菌的物质基础可能是黄酮类成分，这与既往研究报道相似[10-12]。在此基础上，进一步采用网络药理学方法对滇黄芩的主要活性成分、作用靶点、相关生物信号通路等几个方面的关联性进行了探讨，并由“活性成分-靶点-通路”网络图可知芹菜素、黄芩素、5，7，4'-三羟基-8-甲氧基黄酮等可能为滇黄芩抗菌的主要药效物质。研究表明，芹菜素与氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素联用对MRSA菌株呈现协同作用[13]；黄芩素是一种具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等功能的天然生物活性化合物，能够抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，并通过下调NF-κB和p38 MAPK 表达水平对肺炎球菌性肺炎小鼠发挥良好的保护作用[14，15]；其余几种节点较大的重要活性成分文献报道较少，其药效及作用机制需进一步研究证明。

滇黄芩抗菌靶点PPI 网络显示，PTGS2、TP53、AKT1、CASP9、HSP90AA1、JUN 等35 个关键靶点在滇黄芩抗菌中发挥重要作用。有研究表明[16]，中药主要通过PTGS2 参与红素结合和控制双加氧酶活性，产生炎症反应，提高促炎介质水平治疗布鲁氏菌病。当发生幽门螺旋杆菌引发的胃炎感染时，可引起抑癌基因TP53 下调，并且持续的炎症导致TP53 突变与胃癌的发展紧密相关[17，18]。AKT1 与多种细菌感染途径有关，如铜绿假单胞菌感染可通过抑制Akt1/mTOR 通路诱导自噬体形成[19]。GO 生物学过程富集分析显示，滇黄芩抗菌主要涉及药物反应、蛋白结合、酶结合、信号转导、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的阳性调控等生物过程。由KEGG 通路富集网络分析显示，HIF-1、TNF、p53 和FoxO 等信号通路可能是滇黄芩抗菌的关键通路。TNF 是一类具有多种生物学效应的细胞因子，能够与细胞膜上的特异性受体结合，进而促进细胞生长、分化凋亡及诱发炎症等生物学效应，参与抗细菌和免疫调节等生物学过程[20]。HIF-1 通路的激活可增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的杀菌作用[21]。

综上所述，本研究初步揭示了滇黄芩抗菌的关键药效物质为芹菜素、黄芩素、5，7，4'-三羟基-8-甲氧基黄酮，其抗菌的作用机制与HIF-1、TNF、p53、FoxO 通路相关，为后续该药材的合理开发、质量控制、药效物质基础及作用机制研究提供了理论依据。