临床标本中结核分枝杆菌抗原蛋白鉴定的研究进展

盛钢 褚洪迁 刘丁一 孙照刚

2020年，全球约150万例患者死于结核病，其中约21.4万例患者合并HIV感染，结核病仍然是危害人类健康的呼吸系统传染病[1]。2010年，世界卫生组织在一项关于控制结核病的报告中指出，由于各种结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)抗原检测试剂盒的敏感度和特异度存在较大差异，且检测效能有限，暂不建议将各种血清学MTB抗原及抗体诊断试剂用于结核病诊断[2]，其在我国结核病诊断的临床工作中也不断被弱化。

近年来，虽然痰液或者病灶中直接检出MTB是肺结核诊断的金标准，但涂片镜检的阳性率仅有50%左右[3-4]，且易受检测人员技术水平的影响，存在一定的漏检率；培养法周期较长，不利于早诊断、早治疗。考虑到MTB抗原成分无论是来源于MTB细胞壁、细胞质，还是分泌蛋白和某些代谢组分，都是MTB在人体内活动的直接证据，具有区分现症感染和既往感染的能力；且不易受检测人员、实验室环境等影响和结核菌素试验结果的干扰，具有即时检测和床旁检测的潜力，抗原检测在某些角度上优于细菌学直接检查，也优于抗体检测。从检测的便携性、检测成本、检测能力来看，MTB抗原检测值得重新关注和研究，以重新评价MTB抗原检测的应用价值[5]。

MTB抗原蛋白分布广泛，可存在于血液、脑脊液、尿液、痰液、穿刺组织和结核肉芽肿中，因此，在这些标本中鉴定出具有临床意义的抗原直接关系到检测结果的准确性和可靠性。笔者将依据标本类型，对各种临床样本中的抗原蛋白的发现过程、鉴定方法及应用前景进行综述，以探讨MTB检测技术的发展过程与积极意义，为MTB抗原检测技术的研发及临床应用提供理论依据。

结核病患者不同临床样本MTB抗原蛋白鉴定

一、血清

血清是结核病检测最常用的样本之一，目前现行的MTB体外诊断实验诸如γ-干扰素和抗体检测大多需要血清样本。但是，血清样本成分复杂，是人体蛋白质含量最丰富的体液样本，这为MTB抗原鉴定带来了一定困难。目前，研究者应用高分辨率的凝胶电泳技术或者蛋白滤过技术，仍旧可以从血清样本中鉴定出一些有意义的MTB蛋白抗原。Banerjee等[6]利用TAC分馏和凝胶过滤柱层析技术进行一级抗原分离，再利用快速蛋白质液相色谱法(FPLC)进行二级分离，获得了与肺结核和骨结核患者血清高度反应的组分，即肺结核血清循环抗原组分3C(PTS-G3C)和骨结核血清循环抗原组分3B(BJS-G3B)。这两种组分显示出与MTB体外释放的排泄-分泌抗原41(ES-41)相似的FPLC模式。继而，他们在另一项研究中采用硫酸铵沉淀法制备了循环结核抗原蛋白9(CTA-9)，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和FPLC技术，对MTB体外培养滤液进行逐级洗脱，获得了与CTA-9具有相似抗原活性的高血清反应性ES-20。利用ES-20建立的间接ELISA检测方法，对活动性结核病，特别是淋巴结结核显示出了不错的诊断潜力[7]。Harinath[8]利用间接和夹心法酶联免疫吸附测定(ELISA)进一步验证了ES-31和ES-41抗原对不同类型结核病的诊断效果，发现ES-31抗原对淋巴结结核、结核性脑膜炎(tubercular meningitis，TBM)有更好的诊断效能，而ES-41对腹膜结核、骨和关节结核的诊断效果更好。Attallah等[9]利用55 kDa循环结核游离抗原的单克隆抗体(TB-55mAb)在血清、脑脊液、腹腔积液等多种体液标本中鉴定到了分子量为55 kDa的循环结核游离抗原，并建立了基于55 kDa循环结核游离抗原的dot-ELISA检测方法，结果具有较高的敏感度(88%)和特异度(97%)。除使用单克隆抗体进行抗原捕获外，也有研究利用纯化的多克隆抗体鉴定出血液中存在具有免疫原性的抗原，例如43 kDa[10]。综上认为，虽然对血清中MTB抗原蛋白的鉴定有了一定进展，但目前仍缺乏系统发现和鉴定血清中结核抗原的新方法，也没有可用于临床优势抗原的充分证据。

二、组织和肉芽肿

肉芽肿是一种由巨噬细胞、粒细胞、淋巴细胞和成纤维细胞组成的动态空间结构，这些免疫细胞会将MTB包裹，形成境界清楚的结节状病灶，一方面限制了MTB感染扩散，另一方面也使其成为结核病慢性进程中的关键成分[11]。一些研究和临床数据表明，结核肉芽肿中的细菌负载和MTB的代谢活性都会随着疾病进程发生变化，这些代谢变化和肉芽肿的包裹则会对抗酸染色效果产生不利影响[12]。Goel和Budhwar[13]利用MTB 38 kDa抗原的单克隆抗体对肉芽肿中的MTB进行免疫组织化学染色(IHC)，结果显示，在36例临床确诊的肺外结核患者中，使用萋-尼染色，仅有13例为阳性结果，而在IHC组中，所有患者的样本均为阳性结果，并且无假阳性和假阴性结果。Mustafa等[14]比较了MTB感染的肺组织和淋巴结组织中的抗原表达水平，发现肺组织中的大多数MTB的分泌抗原(如MTP32、MTP46、MTP64等)可经IHC染色观察到，这可能是由于肺部形成保护性组织肉芽肿的能力有限，无法有效限制MTB的增殖所致，而在淋巴结中形成了控制细菌增殖的肉芽肿，使得细菌的分泌抗原表达量锐减，但体细胞抗原(如Mce1A、Hsp65、MPT57)的存在也可证明淋巴结结核持续感染的存在；另外，通过IHC方法还确定了15例具有硬化结节和空洞等影像学表现的肺结核患者。而对于细菌学阴性的既往肺结核患者的肺组织肉芽肿病灶，也可以通过病灶内存在的Ag85A和分枝杆菌结合DNA结合蛋白1(MDP1)加以佐证[15]。

除了蛋白抗原外，甘露糖基化脂原甘露聚糖(ManLAM)是目前研究较多的MTB抗原，在病变组织中含量丰富。LAM是MTB细胞壁上的重要成分，能够随MTB的增殖代谢不断地释放出来。Zhou等[16]研究证明了LAM存在于病变组织中，并将基于ManLAM适配体的IHC检测技术用于结核病检测，其总体敏感度(86.38%)和特异度(92.86%)均较高。

以上研究均说明了组织和肉芽肿中结核蛋白和脂类抗原的发现和鉴定必将促进结核病病理学的进一步发展。但其困难的取样方式制约了相应病理快速诊断技术的发展。

三、痰液

痰液标本中找到MTB是诊断结核病的可靠手段，但其阳性率低(50%左右)、易漏检，常需要联合其他检查方法。痰液中的MTB抗原检测本应是一项具有潜力的检查手段，但并未在临床工作中得以有效应用。热休克蛋白(HspX)是MTB的主要抗原，用于稳定细菌的蛋白质和细胞结构、提高细菌的抗宿主免疫能力、逃避宿主的免疫清除，几乎存在于MTB的整个活动期，是活动性结核病公认的生物标志物[17]。Pelaez等[18]也开发了一种无标记表面等离子共振(SPR)生物传感器，用于HspX的床旁检测。这种基于EG硫醇的生物功能化策略的传感器检测系统，未对信号进行任何放大操作，直接反映了机体内的HspX水平，实现了HspX的纳克级(ng)水平检测。

目前，国际市场上已有针对痰液中LAM的ELISA检测试剂盒，这种检测试剂盒仍是基于单克隆抗体研发的，在关于其检测效果的两项队列研究中，均发现痰液样本中LAM的定量检测结果与菌落形成单位(CFU)计数存在正相关，能够在治疗前有效地衡量机体内的MTB细菌负荷[19-20]。另外，由于肺部MTB分泌抗原蛋白的高表达，一些研究针对MTB分泌蛋白MPT64作为靶抗原进行检测[21]，提示其对小儿肺外结核(EPTB)和结核分枝杆菌复合群(MTBC)展现出良好的诊断能力[22-23]。一些公司还推出了一系列针对痰液培养物中MPT64的抗原诊断产品，但绝大部分还未上市。值得一提的是，痰液样本的处理对痰液标本的抗原检测是个考验，目前广泛使用的以碱处理为代表的蛋白变性等液化方法可能会导致抗原被稀释和某些重要抗原表位的丢失。

四、脑脊液

脑脊液标本获取困难，采集过程中患者需承受巨大痛苦，仅用于诊断TBM。MTB侵入中枢神经系统造成的脑损伤和神经炎症是TBM的始动环节，患者常表现为颅内压异常增高，出现脑膜刺激征[24]，在其发生发展过程中，会引发脑膜炎症，病灶部位出现炎性细胞，如中性粒细胞、浆细胞、单核细胞的趋化和浸润，产生混合细胞反应。Song等[25]使用免疫组织化学方法比较了急性起病的TBM患者第1～4周脑脊液单核细胞的MTB早期分泌性靶抗原6(ESAT6)的抗原表达情况，发现TBM患者在急性起病后的第1周和第2周的阳性率均明显高于对照组，且与第4周的阳性率也有明显差异，这表明EAST6是TBM患者早期诊断的有效抗原。在TBM患者中发现的另一个循环游离抗原是30 kDa蛋白，经过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)解离扫描，对产生最大相对丰度的成分进行鉴定分析，证实30 kDa条带的衍生肽存在的Ag85A和Ag85B两个蛋白均属于MTB的主要分泌蛋白—Ag85复合群蛋白。有研究表明，Ag85复合群蛋白参与MTB的细胞壁生物合成和免疫原性反应，在MTB的抗宿主免疫中发挥着重要作用[26-27]。65 kDa是一类热休克蛋白，Mudaliar等[28]应用TB-60mAb在TBM患者中检测到65 kDa蛋白的存在，并建立了间接ELISA方法用于TBM患者的血清学抗原诊断，显示出84%的敏感度和90%的特异度，但有8%的化脓性脑膜炎患者和10%的病毒性脑膜炎患者出现了假阳性结果，这与Song等[25]的报道一致。脑脊液中检测MTB是TBM的重要检查方法，但临床实践证明，脑脊液直接涂片检测的阳性率较低，而GeneXpert MTB/RIF是检测核酸的常用诊断技术，但存在对TBM检测敏感度有限的缺点[29-32]。综上所述，直接检测脑脊液中的抗原蛋白是一种确认MTB现症感染的重要诊断手段，在TBM诊断方面具有光明前景。

五、尿液

尿液样本容易获取，患者依从性好。尿液中MTB抗原检测的阳性率在免疫缺陷群体中更高，如HIV感染患者，这可能与MTB在免疫缺陷人群中负载量更大，进入尿液中的MTB抗原更多有关[33-34]。早在2002年，Choudhry和Saxena[35]就对培养滤液蛋白10(CFP10)在尿液标本中诊断结核病的应用价值进行了评估，他们使用纯化的CFP抗体进行夹心法ELISA检测，发现75%的样本为阳性。近年来，Seifert等[36]采用一种高敏感度的原型生物电子结核抗原(BETA)检测技术进行初诊结核病患者的血清和尿液样本中的CFP10的床旁检测，均显示出较好的诊断价值；另外，值得注意的是，该研究显示尿液中CFP10的含量可能要比血清更高，提示当以CFP10为靶标时，尿液样本也许是更好的选择。

另一个被确定出现在尿液中的经典MTB抗原是LAM，由Hamasur等[37]首先报道，他们将H37Rv的细胞壁超声产物注射到小鼠腹腔，17 h后收集尿液进行夹心法ELISA分析，证实了尿液中有LAM存在。Dahiya等[38]认为尿液中的LAM和CFP10的一种存在形式是细胞外囊泡(EVs)，通过EVs这种独特的形式，将结核抗原组分包裹于脂质双分子层中，以参与细胞间物质运输与代谢[39]。他们利用免疫聚合酶链式反应(I-PCR)对尿液中的LAM和CFP10进行检测，结果显示I-PCR的检测限低于ELISA方法106倍。但尿液LAM检测的敏感度在不同患者人群中存在较大异质性，如低CD4+T淋巴细胞计数的患者(例如HIV合并MTB感染者)对LAM检测的敏感度(67%～85%)明显高于HIV阴性的结核病患者(13%～51%)[40]。

目前，国际上已有来自美国雅培公司和日本富士胶片株式会社的基于侧流尿脂阿拉伯甘露聚糖(LF-LAM)技术的商业化检测试剂盒，用于检测尿液中的LAM，但其目前的应用范围较窄，仅用于HIV合并MTB感染者，且在不同研究中存在敏感度的较大差异，如在未评估结核病症状的HIV阳性患者中诊断结核病的敏感度为35%；在具有结核病临床表现的HIV阳性患者中诊断结核病的敏感度为42%，这可能是HIV阴性患者尿液中LAM浓度更低，且检测结果易被尿液中与LAM结合的基质蛋白所干扰有关[41]。另外，一项Meta分析发现这两种试剂盒对HIV阳性的疑似结核病儿童患者检测的敏感度和特异度更高[42]。Paris等[43]提出的一种用于浓缩LAM的水凝胶纳米笼有效地隔绝了基质蛋白的干扰，提高了尿液中LAM的检出能力。De等[44]认为这可能是由于体内分离获得的LAM与体外培养获得的LAM在结构或者功能方面有所差异，从而导致了检测结果的不一致。因此，他们分别对从C3HeB/FeJ小鼠感染模型的肺脏和HIV阴性结核病患者尿液中分离纯化获得的LAM进行了抗原表位的差异分析，发现来自肺脏的LAM的非还原末端高度琥珀酰化，并以琥珀酰化的线性4阿拉伯呋喃糖苷(Ara4)缀连的甘露糖封端和支链5阿拉伯呋喃糖苷(Ara5)缀连的甘露糖末端基序为主导，而尿液来源的LAM虽也以高丰度的Ara4和Ara5末端基序为主导，但严重缺乏支链6阿拉伯呋喃糖苷(Ara6)缀连的甘露糖末端基序，这说明LAM结构上的差异可能会直接影响LAM与抗体的亲和力，从而影响检测结果。

Pollock等[45]在2例肺结核患者的尿液中发现了一个独特的MTB多肽序列：TBCG_03312，经过BLAST分析，发现该肽段与不同的MTB临床分离株高度同源，与来自MTBC 菌株的TBCG_03312和来自MTB423菌株的氧化还原酶的序列相匹配。进行MTB的体液学抗原鉴定，一个需要考虑的问题是除去患者体液中高丰度的非MTB抗原蛋白，避免其对低丰度MTB抗原的掩盖，Young等[46]使用了50 kDa分子截留过滤器(MWCO)去除尿液中高丰度的大分子量蛋白，收集了30 kDa内的蛋白质，经蛋白质组学分析确定了10种仅出现在结核病患者尿液中的分枝杆菌蛋白。

MTB抗原蛋白鉴定与检测的发展历程与目前存在的问题

早在1987年的一项研究中，科研人员就利用放射免疫技术(RIA)观察到TBM患者脑脊液中的MTB特异性抗原(TB-Ag)和特异性抗体(TB-Ab)均明显升高，认为这些抗原或者抗体检查可能要比脑脊液常规检查更具有诊断意义[47]。随后越来越多的科学家开始关注到MTB抗原检测，根据所检测的抗原类型，抗原鉴定的发展过程大致分为3个阶段：(1)抗原蛋白原始鉴定期：聚丙烯酰胺凝胶电泳技术被广泛应用于MTB抗原的发现与识别中，常以健康人血清为对照进行结果比对，找出结核病患者异常的血清条带，鉴定结果有一定意义，但限于当时的技术条件，大多数研究并未对这些蛋白的多肽和氨基酸序列进行明确分析，其结构和表位大多未知，一些研究者认识到这些蛋白可能融合有多个抗原表位，与非结核性呼吸系统疾病患者血清存在交叉反应，检测结果的特异性难以保证[48]。(2)分泌蛋白鉴定期：这一时期，色谱技术、质谱技术和等电点聚焦电泳等物质分析技术逐渐兴起，随着对编码MTB抗原蛋白基因结构的认识与发展，MTB抗原鉴定逐渐向分子生物学水平靠近。分泌蛋白EAST6和CFP10的分离与表征是MTB抗原蛋白鉴定的重要突破。Sørensen等[49]在MTB培养滤液中发现了一种由95个氨基酸组成的多肽序列，经DNA序列翻译后比对和N段系列分析，发现其具有刺激T细胞分泌γ-干扰素的能力，而并非污染蛋白，这也标志着以EAST6为代表的MTB培养滤液蛋白抗原的发现。随后，Berthet等[50]鉴定出了与EAST6共同转录的新基因：lhp，该基因的产物是来自MTB培养滤液的低分子量蛋白质CFP10，这两个低分子量蛋白目前仍旧是MTB抗原研究领域的焦点[51-53]，但EAST6和CFP10目前也仅用于结核分枝杆菌潜伏感染的筛查和肺外结核的辅助诊断，其辅助诊断结核病的价值、区分潜伏性和感染性结核病的能力也有待评估。(3)活性肽序列抗原鉴定期：虽然已经在各种临床标本诸如血清、尿液、脑脊液标本中鉴定出了多种具有意义的MTB抗原蛋白，但正如世界卫生组织所质疑的，这些抗原蛋白检测结核病患者的敏感度和特异度在不同的研究中具有明显差异，抗原蛋白鉴定的稳定性及试验的可重复性目前也难以保证，这限制了抗原检测技术在临床诊断中的应用推广。

当前需要对所鉴定的抗原蛋白的临床可靠性和检测方法的适用性进行深刻反思。需要考虑的因素主要包括以下几个方面：(1)不同临床标本中的MTB抗原蛋白是否与天然结构一致，经过机体复杂的代谢后这些抗原蛋白发生了怎样的变化？(2)所检测的MTB抗原蛋白是否适用于所有类型的结核病患者？例如，结核分枝杆菌潜伏感染者与活动期结核病患者、单纯结核感染患者与合并免疫缺陷疾病的患者、菌阴患者与菌阳患者等，目前已有一些研究针对不同患者类型的检测效果进行了详细探究，但总体来说还没有定论。此外，是否有抗原蛋白存在于MTB感染的全周期，并能够以稳定的形式存在于临床样本中也鲜有研究。(3)为了使检测方法更为灵敏，多应用ELISA、免疫荧光等技术将检测信号显著放大，这也可能会导致假阳性的产生，过度的信号放大以及检测原理的差异是导致各检测方法结果差异较大的重要原因。(4)检测单一MTB抗原可能会与其他致病菌产生交叉反应，导致假阳性结果。

基于以上问题的考量，科学家们不再将抗原鉴定的目标集中于菌体本身或者分泌的抗原蛋白，而是开始应用基因组学和蛋白质组学分析标本中抗原的存在形式与结构，逐渐关注抗原蛋白的体内外差异，已经在结核病患者血液和尿液中发现了一些不同于以往发现的任何天然蛋白的多肽序列。为避免抗原交叉反应导致的假阳性和提升对活动性结核病及结核分枝杆菌潜伏感染的鉴别能力，一些研究采用联合抗原检测[54-55]，也有研究将不同的抗原表位进行融合，建立融合蛋白检测，这是一个颇有潜力的思路[56]。另外，有的研究已经关注到过度的信号放大给检测结果带来的不利影响，研究者在不进行任何信号放大的条件下，使用新型技术如无标记表面等离子共振生物传感器直接对MTB抗原蛋白进行定量检测。同时，基于适配体的抗原检测技术也值得我们关注，适配体内涵广泛，核酸、蛋白、脂质都可以作为抗原的适配体，并且随着物质互作分析技术的不断发展，适配体技术将为MTB抗原蛋白的鉴定与检测开创新的格局[57]。

结 论

MTB抗原鉴定是抗原检测技术的基础和前提，鉴定出具有临床意义的抗原对MTB抗原检测新技术的研发具有重要意义。而目前基因组学、蛋白组学等分子生物学方法的快速发展，为MTB抗原鉴定开辟了一条新渠道。另外，要着重关注抗原蛋白在机体内的存在形式，探究抗原蛋白的体内外差异，这将为MTB抗原蛋白鉴定创造积极意义，并且有助于疫苗的研发。同时，纳米技术、生物传感技术、抗原富集技术与MTB抗原检测的不断融合[58]，也将推动MTB抗原检测技术的临床应用，使之获得更多青睐。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献盛钢：资料收集、分析与撰写；褚洪迁和刘丁一：文章修改；孙照刚：提出文章撰写思路